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《临八---高校---十、设计实验-》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、十、细胞冻存时间对脾脏细胞活力的影响【实验目的】1.细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的彩响。2.学习细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。3.了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。【实验原理】mm,细胞冻存是细胞保存的主要方法Z—。利用冻存技术将细胞置于-196°C液氮小低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而R适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢利A起到了细胞保种的作用。细胞冻存时向培养基屮
2、加入保护剂一终浓度5%.15%的甘油或二卬基亚W（DMS0）,可使溶液冰点降低，加Z在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用〃慢冻快融〃的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为T到-2°C/min,当温度低于-25°C时可加速，至卜80°CZ后可直接投入液氮内（T96°C）。UlinMTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体屮的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT述原为水不溶性的蓝紫色结品甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而
3、死细胞无此功能。二甲基亚砚（DMSO）能溶解细胞中的卬瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（0D值），可间接反映活细胞数量。在一•定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用丁•一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。【实验材料】1.器材：试管，吸管，培养瓶（灭菌），倒置显微镜，酒精灯，酒精棉球，试管架，CO?细胞培养箱，超净工作台，铁了，注射器，离心机，巴氏管，血球计数板，大头针，二氧化
4、碳培养箱，眼科剪，眼科镶，培养皿，培养瓶，离心管，吸管，酒精灯，培养基，盖玻片，滴管，显微镜，恒温水浴箱，冰箱（JC、-20°C.-70°C）,培养箱，液氮，冰箱，吸管（弯头、直头），废液缸，移液管（10ml）,冻存管（1〜2ml）,微量加样枪，移液枪，酶联免疫检测仪，摇床。2.试剂:PBS,0.25%胰蛋白酶，DMEM培养液，3%谷氨酰胺，小牛血清，7.4%NaHC03,双抗溶液，0.5%台盼兰染液,D-Hanks液,小牛血清，DMSO或无色新鲜甘油，MTT（5mg/mL）。以上试剂均需分装，包扎
5、好，灭菌后备用。配置营养液DMEM液90%.小牛血清10%.双抗100单位/ml.3%谷氨酰胺1mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2【实验步骤】（1）制备脾脏细胞，进行传代培养（2）传代后的脾脏细胞分为两组：A组进行细胞冻存，冻存时间分别为：5h,24h,3d,15d,30dB组用MTT法测定细胞活性，并记录下细胞形态。（3）A组冻存的细胞经过复苏后分别用MTT法测定细胞活性，并记录下细胞形态。与B组结果做比较，得到细胞冻存时间对脾脏细胞的影响。1・脾脏细胞的原代培养（1）取材取小白鼠一只
6、，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精屮灭菌3分钟。取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，银起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿。（2）分离脾细胞用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用型针头注射器在血屮吸取PBS液0.2ml,然后将英沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿屮的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1-2分钟。吸取上述
7、静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppcndorf管，并使量至lml,以3000r/分离1—2分钟。（3）培养脾细胞取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200U1）”吸取塑料皿中的培养液400u1加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200u1脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37°C、5%二氧化碳培养箱中培养。2.脾脏细胞的传代培养（1）用75%的酒精擦拭双手，取出待传代的细胞。移去培养皿屮的I口培养基，加入5mL
8、PBS清洗残余的旧培养基，清洗两次，移去PBS。（2）补充营养液并以1：2的比例分装。（3）将分装好的细胞瓶做好标记，注明细胞代号、日期、置丁•培养架上，轻轻摇动，以使细胞均匀分布，以免细胞堆积成【才I，然后置于含5%C02,37°C细胞培养箱培养。（4）观察：细胞培养24h后，即可进行观察，主要观察：细胞是否被污染，主要观察培养液颜色的变化及浑浊度。•培养液正常情况下为桃红色；颜色变黄时，必须换液。•真菌污染较为多见，大多形成口色或浅黄色小点浮于培养表面，肉眼可见；
