细菌分子生物学鉴定法的分析【文献综述】

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1、毕业设计文献综述生物科学细菌分子生物学鉴定法的分析[摘要]：本文综述了目前主要使用的菌种分离与鉴定的几种分子生物学鉴定方法，分析其原理及一些影响因素，阐述各自的优缺点，并根据各自的应用范围和条件，选择出适于本次研究的方法。[关键词]：分子生物学方法；菌种鉴定；核酸检测技术细菌鉴定是指将分离培养获得的菌体,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定。系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群)。目前常用的细菌鉴定方法主要有形态学鉴定、生理生化特征及碳源利用、分子生物学鉴定[1

2、,5]。分子系统学是通过检测生物大分子（以核酸和蛋白质为主）所包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义，从而在分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律的一门学科[2]。20世纪70年代末，Woese等以16SrRNA、18SrRNA序列为研究对象，提出了三域学说。对于原核生物来说，16SrRNA是目前研究分子系统学最好的材料，是最古老的分子之一[2]。研究不同生物的16SrRNA有利于研究生物的发生及其分歧年代。作为蛋白质合成的场所，16SrRNA广泛存在于真核和原核生物的细胞中；分子长度为1.5kb，相比其他分子，既保证了较大的信息量，又便于扩增和测序；

3、由于具有强烈的功能制约，16SrRNA是保守的分子，只有16SrRNA的保守性才能保证蛋白质合成的相对稳定性；但保守性并不意味着不变，这种保守是相对的，有的区段保守性高，有的区段变化很大，这种保守又变化、总体保守局部变化的特性显示了生物界的共性和特异，这正好适于系统进化。1分子生物学鉴定技术1.1PCR技术1.1.1PCR技术的原理及特点5PCR技术快速敏感、简便易行，其原理为：DNA双链分子经过热变性后，分解成两条单链分子；温度降至一定程度后引物与单链DNA分子结合；然后DNA聚合酶以DNA单链为模板，并利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，从引物向后延伸合成新的DNA互补链[5]。反应

4、可以周而复始，使目标DNA序列得到迅速大量的扩增。PCR反应有两个特点：①目的性强，反应所需要的引物是专门设计的，具有很高的特异性。②目标DNA的拷贝数量大。1.1.2PCR技术的影响因素在PCR反应过程中，影响反应效率的因素众多，循环参数以及反应成分都会对其产生影响。比如变性温度、退火温度、TaqDNA聚合酶的浓度、dNTP浓度都会影响到PCR扩增的产量，而退火温度、TaqDNA聚合酶的浓度、Mg2+浓度、引物浓度、模板浓度则会影响到PCR扩增的特异性[7,9]。除通常的PCR以外还有热启动PCR、多重PCR、降落PCR。其中热启动PCR能够解决如非特异性扩增、引物二聚体的形成等问题；多

5、重PCR可用于庞大基因的检测，同时用多个引物进行扩增，提高反应的敏感性和特异性；当引物和其目标序列的杂交体的溶解温度不确定时，可用降落PCR优化扩增DNA的产量。尽管PCR技术以其明显的优势在细菌分类鉴定中起到了巨大作用,但也有一定缺点,主要是引起一定程度的单核苷酸的错误掺入，而且微量的外源DNA进入PCR引起的无限放大可产生假阳性结果[4]。1.2DNA同源性分析DNA/DNA杂交是将待测的不同来源的DNA在体外加热使其解链，并在合适条件下使互补的碱基重新配对，然后测定杂交百分率。1987年国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性大于等于70%或杂交分子的热解链温度差小于或等于2℃为细菌“

6、种”的界限。DNA的杂交值和结合率可反映出两基因组序列的相似性，此值越高，说明两碱基顺序的同源性越高，即其间的亲缘关系越近[8,10]。现已证明，每错配1%，杂交热稳定性降低1%-2.2%，但目前还不能确切地将杂交值或结合率转化为基因组序列的相似性。DNA/DNA杂交和16SrRNA基因序列分析这两种方法已经成为了细菌分类鉴定中的基本方法，是描述细菌分类单元中种属的一项基本标准。为细菌种和属的分类研究开辟了新途径，解决了表型分类法所无法解决的一些问题,并对新种的确立十分重要。但对于属或属以上的分类鉴定则采用DNA-rDNA杂交的方法。5进行DNA-DNA杂交的方法有很多，但归纳起来主要有两

7、种：一种是液相杂交，即杂交反应在溶液中进行；另一种是固相杂交，即先将未标记的单链DNA固定在消化纤维素膜或尼龙膜上，然后再杂交。影响杂交的主要因素有：①反应物的浓度；②缓冲液的离子强度；③温度；④有机溶剂；⑤在异源杂交中核苷酸序列错配的程度；⑥核酸遗传信息的复杂性等。在各种杂交方法中，除杂交温度外，绝大部分的变量是固定的。同时，温度也根据要求的杂交严格程度而变化。严格杂交温度有利于完全互补的核苷酸序列的杂交，而非严格杂交