第十四章-基因重组与基因工程lj

《第十四章-基因重组与基因工程lj》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第十四章基因重组与基因工程第一节自然界DNA重组和基因转移第二节重组DNA技术克隆（clone）克隆即指同一副本或拷贝（copy）的集合；获取同一拷贝的过程叫克隆化。自众多分子中分离获得相同分子，即为分子克隆，在分子生物学和遗传学领域所谈的分子克隆专指DNA克隆.DNA克隆(DNAcloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（genecloning）,基因工程重组DN

2、A技术（recombinantDNAtechnology）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。克隆体系：目的基因载体DNA工具酶宿主细胞1、目的基因（targetgene）：cDNA或基因组DNAcDNA（complementaryDNA）：指体外经反转录合成的，与RNA（常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA（genomicDNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等质粒（plasmid）：存在于细菌染色体

3、外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。质粒载体理想质粒载体的条件：1、环状DNA，具有自主复制能力；2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开；3、分子量相对较小（2kb～数百kb），能够容纳目的基因；4、具有较多单一限制性内切酶位点；5、有一个或多个筛选标记；6、具有较高的遗传稳定性。TheconstructedplasmidpBR322质粒载体外源基因插入位点EcoRⅠ含一个复制起始点（ori）抗药基因terr和ampr1977年由Boliver和Rodriguez等人自E.coli的天然质粒建

4、成。1、克隆载体AnexampleofanE.coliexpressionvector质粒载体2、表达载体外源基因插入位点复制起始点（ori）标记基因启动子调控序列3.1限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。3、工具酶：许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构回文结构：DNA的两条链呈旋转对称，即中心轴两侧的碱基序列为互补序列。【经典举例】EcoRI5’端---GAATTC---3’端3’端---CTTAAG---5’端限制性核酸内切酶限制性内切酶切

5、割产物：具有5’磷酸基和3’羟基基团由于酶的作用不同可以产生三种切割末端。（1）5’突出末端：如EcoRI5’端---GAATTC---3’端3’端---CTTAAG---5’端5’AATTC---3’3’G---5’5’---G3’3’---CTTAA5’酶识别DNA序列的长短不同，一般为4-18bp（3）平头钝性末端：如HpaI限制性核酸内切酶5’端---GTTAAC---3’端3’端---CAATTG---5’端5’---GTT3’3’---CAA5’5’AAC---3’3’TTG---5’（2）3’突出末端：如PstI5’端---CTGCAG---

6、3’端3’端---GACGTC---5’端5’---CTGCA3’3’---G5’5’G---3’3’ACGTC---5’3.2DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段(Klenow酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等3.3DNA连接酶T4连接酶：可用于粘端与平端的连接工具酶功能限制性内切酶识别特异序列、切割DNADNA连接酶连接DNA片段DNA聚合酶I合成DNA反转录酶合成cDNA多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5末端磷酸化末端转移酶在3羟基末端进行多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞分、切、接、转、筛、

7、表达第三节DNA克隆的基本过程一、“分”：目的基因及载体的制备1、分离基因的方法：化学合成、基因组DNA、cDNA、PCR、基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库cDNA文库(cDNAlibrary)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。聚合酶链

8、反应（polymerasechainreaction，PCR）：在