上海交大医学院细胞生物学技术考试重点

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1、一、显微镜技术1、分辨率（resolution）:用于表示人眼和仪器，能够辨别两点之间最小距离的标志，是衡量显微镜性能的重要指标。人眼的分辨率由人眼的生理结构决定。光镜由光波波长和物镜数值孔径决定。电镜由电子束半波长决定。分辨率极限：人眼（0.1mm）;光镜（0.2pm）;电镜（0.2nm显微镜技术优化核心是提高分辨率，体现在两个方面:（1）光源的采用（2）样品制备和信号呈现方法使信噪比提高。2、显微镜分类：（1）光学显微镜：普通光学显微镜；荧光显微镜（激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率荧光显微镜、活细胞荧光工作站）；相差显微镜：观察活细胞；微分

2、干涉相差显微镜（DIC）:活细胞三维立体投影影像（2）电子显微镜：透射电子显微镜（TEM）;扫描电子显微镜（SEM）;分析电子显微镜;高压电子显微镜；冷冻电子显微镜（3）扫描探针显微镜：原子力显微镜3、普通光学显微镜主要三部分：聚光镜、物镜、目镜；光源：可见光样品制备5步：固定（甲醛）；脱水（乙醇）；包埋（石蜡）；冰冻切片（1-10pm）;苏木精伊红染色（HE染色）4、荧光显微镜光源：高压汞灯、弧光灯荧光的来源:（1）细胞和组织自发荧光（2）外源导入荧光蛋白：动态检测、活体检测、长时间检测、容易融合（3）荧光染料：口丫唏橙染色DNA（绿'RNA（

3、橙）（4）荧光标记抗体：荧光染料与抗体共价结合（5）荧光探针：金属离子探针、细胞内pH值~、细胞内活性氧~、线粒体跨膜电位~。5、荧光素（Fluorphore）:吸收能量后具有发光现象的物质，通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光，并随照射停止而消失。荧光素发射光减弱(光漂白)或消失(淬灭)06、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM):以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。7、简述激光扫描共聚焦显微镜的原理(光源点，物点，像点，三点共辄)以激光作为激发光源；结构上采用双针孔装

4、置，形成物像共聚焦的独特设计；激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源，再经物镜在焦平面对样品逐点扫描。样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，被光电倍增管探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面共聚焦图像。8、激光扫描共聚焦显微镜的功能：(1)薄层断层扫描(光学切片)(2)多通道同时扫描：激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描(3)ZOOM成像：在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。(4)多维度扫描：Z轴扫描(垂直)或T扫描(时间)(5)荧光定量分析9、激

5、光扫描共聚焦显微镜技术在医学及生物学研究中的应用(1)静态：分子定位、定量分析、分子间相互作用(2)动态：分子或细胞活动的动态变化：蛋白质的移位；蛋白质相互作用的研究(FRET)；分子运动的测量(FRAP);离子浓度变化趋势的检测10、简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。LSCM的优缺点。类别LSCM荧光显微镜光源激光(紫外光、可见光、近红外)短波长光源(多为紫外光)照明方式点照明、逐点扫描落射式样本信号焦平面的样本信号几乎无次可有多个平面的样本信号伴级荧光干扰随相邻部位干扰图像采集系统荧光信号被PMT探测器接收实时观测，数字化图像，可以进

6、行图像处理和定量分析照相机的原理LSCM的优缺点：LSCM优点:(1)高水平分辨率：0.18pm(2)高垂直分辨率：沿Z轴逐层扫描(3)高灵敏度，信噪比良好(4)能定时、定位、定性、定量缺点:(1)分辨率极限:0.15pm(2)观测厚度:50-100pm(3)逐点扫描，成像速度慢(4)伪彩色11.LSCM和电子显微镜的区别激光共聚焦显微镜电子显微镜工作原理光波的透射电子的透射成像效果微米级(荧光标记)纳米级研究目的观察分布、表达量观察细微结构12.超高分辨率荧光显微镜的原理［突破”衍射极限，提高分辨率(50nm)(1)基于点扩展函数调制：点扩展函

7、数变小(2)基于随机单分子定位：不会有两个靠的很近的点同时亮起来13、电子显微镜：以电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子信号成像，具有高分辨率和放大倍数的显微镜，用于研究组织和细胞的超微结构。14、电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性，电镜利用电子束作为“光源”成像。15、透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子,利用透射电子信息成像的称为透射电镜。16、二次电子：在入射电子的轰击下，样品表面5-50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。17

8、、TEM成像和工作原理：（1）电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子（2）带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光