华科生化教案

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1、实验一还原糖和总糖的测定（3,5--硝基水杨酸比色法）一、实验目的1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用二.实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有口由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖的溶解度不同，可将植物样晶中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（常以葡萄糖含量计）0还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂

2、3,5-二硝基水杨酸则被还原为桔红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与桔红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540mn波长下测定吸光度，参照标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖甘键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9[=6（162n+18）/180n](DNS)加热+还原糖”碱性（3—氨基一5—硝基水杨酸）黄色桔红色三、实验材料和仪器1、实验材料面粉；lmg/mL葡萄糖标准液；3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂；碘-碘化钾溶液；酚駄指示剂；6mo1/LHC1；6mol/LNa

3、OH；2mol/LNaOHo2、实验仪器试管：15mniX180niniX12；烧杯：100mLX6,SOOmLXl,锥形瓶：lOOmLXl；容量瓶：100mLX3,25mLX1;吸量管：10mLX3,2mLX3,lmLX3；恒温水浴锅;900mL烧杯(或不锈钢杯子)XI；载玻片；玻璃棒；胶头滴管；分光光度计；漏斗；滤纸；试管架；擦镜纸；电子秤等。四、实验过程1・样品溶液制作(1)还原糖的提取用lOOmL烧杯准确称取0.65g面粉，先用少量蒸憎水调成糊状，然后加入15mL蒸倔水，搅匀，置50°C恒温水中保温20min,并不断搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在2

4、5mL容量瓶中，用蒸谓水定容至刻度线，作为还原糖待测液。(2)总糖的水解和提取用lOOmL锥形瓶准确称取0.5g面粉，加15mL蒸憾水及10mL6mol/L盐酸，置沸水浴中加热水解30min,吸出一滴滴在载玻片上，用碘-碘化钾溶液检查水解是否完全，若溶液不变蓝色说明水解完全。待锥形瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚駄指示剂，用611101/LNaOH溶液中和，接近滴定终点时改用2mol/LNaOH溶液中和至微红色，用蒸谓水定容在lOOmL容量瓶中。过滤，収滤液lOmL,移入100mL容量瓶中定容，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。2.制作葡萄糖标准曲线及样品中

5、还原糖和总糖的测定取12支15mmX180mm试管编号，按下表分别加入浓度为1.Omg/mL的葡萄糖标准液、样品溶液、蒸憎水和DNS试剂，配成不同浓度的反应液。根据0-9号管测定的数据，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样晶的吸光度在葡萄糖标准曲线上查出相应的糖量。试剂管号0123456789还原糖总糖葡勰标准液(mL)0.00.20.40.50.60.70.81.01.21.4//样品溶液(mL)//////////1.51.5蒸憎水(mL)2.01.81.61.51.41.31.21.00.80.60.50.5DNS(mL)

6、1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量(mg)0.00.20.40.50.60.70.81.01.21.4//将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入16.5mL蒸馆水，摇匀。在入=540nm处测定吸光度，注意用0号管调零。A=540处测定吸光度五、结果与计算按下式计算岀样品屮述原糖和总糖的白分含量:、才严也皿mix25^-1.5.cc还原糖％=xlOO加2x1000总糖％二"上1・5%稀释倍数X0.9X100m2x1000式屮，叫为根据葡萄糖标准1川线屮查出的还原糖或总糖的含量(m

7、g)；m2为样品重量；1000为mg换算成g系数。六、注意事项1.在称取面粉时，注意量程，烧杯、锥形瓶等不可用小量程天平称量。2.在还原糖提取步骤中的定容过程中，应沿壁缓慢加入蒸懾水，否则可能会使液面上产生人量气泡导致不易定容。3.在检查水解是否完全时，注意不要吸取过多总糖提取液，以致最终结果小。4.使用分光光度计之前要预热10-20mino5.试管沸水浴后应先用流水冲洗再放入大烧杯中进行冷却，避免因温度变化剧烈而导致试管炸裂。［思考题］1、在样品的总糖提取时，为什么要用浓HC1处理？而在其测定前，又为何要用NaOH屮和？2、在X=540nm处测定吸