细胞生物学-细胞调亡

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1、一、凋亡概念的形成：1965年澳大利亚科学家Kerr发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞,这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。1972年Kerr提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始,在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡定义:是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的结束生命的过程。细胞凋亡(Apoptosis)蝌蚪向蛙发育的变态反应发育过程中手和

2、足的成形过程发育中神经细胞数量的调节诱导细胞调亡的因子◆物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。细胞凋亡形态变化特征（1）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，染色质固缩.沿着核膜分布。（2）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的

3、细胞膜所包围。（3）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。A、NormalcellB、Apoptosis:Apoptoticbodies胸腺细胞正常凋亡是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。细胞坏死早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。细胞凋亡与坏死(necrosis)ApoptosisNecrosisDeathbyapoptosisisaneat,orderlypr

4、ocess细胞凋亡与坏死的区别①胞浆内Ca2+浓度升高。②DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180～200bp特征性的DNAladders。细胞凋亡的生化特征ApoptosisinducedbyCytoCLane1．0h2．1h3．2h4．3h5．4h6．Control7．Marker③凋亡细胞tTG（组织转谷氨酰胺酶）积累并达到较高水平形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察细胞凋亡的检测NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapop

5、tosisprocess（488nm400）电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，核内染色质高度盘绕，出现许多空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS。将Annexin-V进行荧光素（FITC）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜

6、检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸（PhosphatidylserinePS）外翻分析（AnnexinV法）ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinVDNA片段化分析细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。TUNEL测定法是terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediate

7、ddUTPnickendlabeling的缩写，意指末端脱氧核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法。这一方法能对DNA分子中3’-OH断裂缺口进行原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端，可藉助一种可观测的标记物，如荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。TUNEL测定法:即DNA断裂的原位末端标记法细胞凋亡的基因调控机制最先是从线虫（c.elegans）研究开始的(MIT:RobertHorrid,1986)。线虫是一种细胞定数细胞，在个体发育中，成体的1090个体细胞中，有1

8、31个注定是要自然凋亡。三、细胞凋亡的分子机制Celegans:amm,transparentbodyonlyafewcelltypes,fromzygotetomatureadultonlyin3.5days.1、与PCD有关的基因，负责PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。CED-3是一个蛋白酶，激活的CED-3可以水解靶蛋白从而使细胞死亡，是细胞杀手；Ced-4对ced-3引起的体细胞凋亡起促进作用。ced-9可抵消ced-3的作用，防止细胞被杀死，在