第七章 杂菌和噬菌体的防治

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1、第七章工业发酵染菌的防治第一节工业发酵染菌的危害一、染菌对各种发酵的影响对于不同产物的发酵,由于菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质不同,受污染的危害程度也不同;二、不同杂菌污染对发酵的影响同一产物发酵不同种类杂菌污染所产生的危害程度也不同;三、染菌对产物提取和产品质量的影响丝状菌发酵被污染后,大量菌丝自溶,发酵液发粘,发臭;发酵液过滤困难,严重影响产物的提取收率和产品质量。第二节杂菌污染的防治一、杂菌的检查方法:(1)显微镜检查法:用革兰氏染色剂对样品进行涂片、染色后,在显微镜下观察微生物的形态特征,根据生长菌株的生长特征及形态与杂菌不同,从而判断是否存在杂菌

2、;(2)培养皿划线培养或斜面培养检查法:生长菌株生长培养基灭菌、冷却后37℃保温24小时,先检查灭菌是否完全,若无菌表明灭菌完全,再划线接种,分别于37℃和28℃培养24小时,检查是否有杂菌存在;(3)肉汤培养检查法:将需检查样品接入已灭菌并经过无菌检查的肉汤培养基中,放置37℃和28℃分别培养24h,进行观察,并取样镜检。二、原因分析:染菌的主要原因:种子带菌,培养基或设备灭菌不彻底,无菌空气带菌,设备渗漏,中间补料染菌,接种操作不当、取样操作问题等;1、从染菌的时间来看:种子培养基染菌:斜面菌种染菌,种子培养基或设备灭菌不彻底,接种操作不当,设备渗漏等原因引起染菌。

3、发酵早期染菌:种子带菌、发酵培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当、无菌空气带菌等;发酵后期染菌:空气后期过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及取样操作问题等;2、从污染杂菌的种类来看:耐热的芽孢杆菌:培养基或设备灭菌不彻底或设备存在死角引起;球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌:种子带菌、空气除菌不彻底,设备渗漏和取样操作问题等引起;真菌污染:设备或冷却管渗露,无菌室灭菌或培养基灭菌不彻底,无菌操作不当等引起;浅绿色菌落的杂菌:水污染(即冷却管穿孔);3、从染菌的规模来看:大批量发酵罐染菌:发生在发酵前期,可能是种子带菌或连消设备引起;如果发生在发酵中期、后期,且这些

4、杂菌类型相同,则一般是空气净化系统存在问题;部分发酵罐染菌:如果发生在发酵前期,可能是种子染菌,连消系统灭菌不彻底;如果是后期染菌,则一般是中间补料染菌。个别发酵罐连续几批染菌:设备渗漏引起;三、杂菌污染的防治1、杜绝种子染菌:应加强接种室的消毒管理工作,定期检查消毒效果;严格接种及移种的无菌操作;如果菌种不纯,则需反复分离,直至完全纯化为止。对于已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌种,应予废弃。在平时应经常分离试管菌种,以防菌种衰退、变异和污染杂菌。对于菌种扩大培养的工艺条件和种子质量要严格控制,在种子扩大培养各阶段每隔4～8小时取样进行无菌检查,最后一级种子培养好以后

5、必须先冷冻保压,取样做纯种试验,确证种子无杂菌污染,才能向发酵培养基中接种。2、消灭设备和管道死角:常见的死角有,排气挡板有死角;不用的开孔法兰造成死角;温度计套子造成死角;取样管焊接时造成死角;冷却管排管支架焊接有死角;法兰连接、阀门有死角;罐底积渣,不锈钢衬里焊接不好有死角;淀粉培养基灭菌时温度高,而造成在罐内各部位粘结成为死角;防止死角的措施,发酵罐每使用一次要彻底洗刷一次,消除死角;3、防止设备渗漏:设备经常受高温、高压和突然冷却冲击,容易腐蚀、穿孔、渗漏、因此应经常检查、更新;4、培养基和设备灭菌必须彻底:(1)对于麸皮、黄豆饼一类固形物含量较多的培养基,采用

6、罐外预先配料,再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效;(2)对于培养基灭菌,在灭菌升温时,要打开排气阀门,使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气,避免由于假压而造成的培养基灭菌不彻底。(3)添加消泡剂,防止泡沫中杂菌未杀死,防止泡沫升顶溢出;5、加强空气净化,防止空气带菌:(1)减少进口空气的含菌数;(2)加强对空气的除油、除水,提高介质过滤效率;(3)合理设计过滤器。四、染菌的挽救和处理:1、种子染菌:种子培养主要是生长繁殖菌体,菌体浓度低,培养基营养丰富,比较容易染菌。当发现种子染菌后,均应灭菌后排出,并对种子罐、管道、空气过滤器进行检查,灭菌;采用备用种子,选择生长正常无污染的

7、种子接入发酵罐,继续进行发酵生产。2、发酵前期染菌:发酵前期主要是菌体生长繁殖,代谢产物生成少,此时容易染菌,污染后杂菌迅速繁殖,与生产菌争夺营养成分和氧气,干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成,要特别防止发酵前期染菌。染菌危害较大时,可采取排出部分料液,再补加部分料液,重新灭菌、接种;若染菌对发酵危害不大时,可继续运转,在发酵过程中密切注意代谢情况,采用降低罐温、调整补料数量等措施;3、发酵中期染菌:发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢,影响产物的生成;染菌后应根据发酵类型,产物性质和生成情况,所染杂菌的性质,幅度和危害程度、营养成分消耗等具