第19章 生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用

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1、临床免疫学检验技术肖建华第十九章生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用讲授内容第19章生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用第一节生物素的特性第二节亲合素和链霉亲合素的特性第三节生物素与亲合素结合反应的特点第四节BAS在免疫检测技术中的应用1．掌握生物素-亲和素系统的特点2．掌握BAS在免疫检测技术中的应用3．熟悉生物素-亲合素系统多级放大效应的原理4．生物素和亲合素（链霉亲合素）的理化性质5.了解活化生物素的制备方法教学目标概述生物素-亲合素系统（biotin-avidinsystem，BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种

2、新型生物反应放大系统。生物素与亲合素间高度亲合力，结合迅速、专一、稳定。既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核素等各种示踪物标记。概述1个亲合素与4个生物素化分子结合及1个大分子物质能与多个生物素结合特点，使BAS产生多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的敏感性。目前，BAS已广泛应用于整个生物学领域，是微量抗原与抗体定性、定量检测及定位观察研究的常用技术，也是生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。讲授内容第一节生物素的特性一、生物素理化性质二、活化生物素一、生物素理化性

3、质生物素（biotin，B）为含硫水溶性维生素，又称维生素H或辅酶R；动植物组织中广泛分布，卵黄（α型）和肝（β型）含量高，亦可人工合成。分子式：C10H16O3N2S；MW：244.31Da。既能与抗原、抗体大分子生物活性物质结合，又能与各种示踪物（如酶、荧光素等）结合。一、生物素理化性质咪唑酮环噻吩环羧基ⅠⅡⅠ环为咪唑酮环，与亲合素结合部位；Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构。生物素侧链末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物—活化生物素。二、活化生物素活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶

4、联形成生物素化标记物。标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素二、活化生物素CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）ⅠⅡ1.标记蛋白质氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质。生物素小分子与大分子抗体或酶结合后会产生空间位阻效应，对生物素与亲合素的结合以及BAS的应用效果造成干扰

5、。如何减小空间位阻长臂活化生物素（BCNHS）：在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，增加B与大分子间的距离，减少位阻效应，更好发挥生物素的活性作用。？标记蛋白质氨基与醛基的活化生物素醛基氨基长臂2个6-氨基已糖分子2.标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物用于标记偏酸性糖蛋白。肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸氨基连接后与无水肼反应而成BCHZ还可标记氨基。3.标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素。4.标

6、记核酸的活化生物素(1)光敏生物素(photobiotin)：侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后变为芳香基硝基苯，与腺嘌呤N-7位氨基结合，形成生物素化的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。(2)生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）：作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法通过DNaseⅠ和DNA聚合酶Ⅰ的作用而掺入到双链DNA中。(3)BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4位氨基结合，形成生物素标记的核酸探针，但对碱基配对有影响。（不常用）活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价；可标记生物活性大

7、分子，如抗原、抗体。BNHS多标记抗体，BHZ则多标记偏酸性抗原，标记后抗原、抗体活性不变；可对示踪物标记，碱性磷酸酶标记后活性将降低。生物素标记蛋白质特点讲授内容第二节亲合素和链霉亲合素的特性一、亲合素二、链霉亲合素亲合素(avidin,A/AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。（实际应用中多用链霉亲合素）二者均为大分子蛋白，目前所有用于标记的物质均可与亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。能与生物活性分子抗原、抗体结合，也能与示踪物结合。多与酶、荧光素及胶体金偶联。结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖

8、基分子量68kD65kDpI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性U13～1515～18亲合素(AV)链霉亲合素(SA)SA的pI低，表面所