人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白aFABP酶联免疫分析

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1、人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)的含量。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)水平。用纯化的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP),再与HRP标记的脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在

2、HRP酚的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品屮人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aFABP)浓度。试剂盒组成:试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1个1个酶标包被板1X481X962-8°C保存标准品：54ng/L0.5mlXI瓶0.5mlXI瓶2-8°C保存标准品稀释液1.5mlX1瓶1.5mlXI瓶2-8°C保存酶标试剂3mlXl瓶6mlXl瓶2・8°C保存样品稀释

3、液3mlXI瓶6mlX1瓶28C保存显色剂A液3mlXl瓶6mlXl瓶2・8°C保存显色剂B液3mlXI瓶6mlX1瓶28C保存终止液3mlX1瓶6mlX1瓶2・8°C保存浓缩洗涤液(20mlX20倍)XI瓶(20mlX30倍)XI瓶28C保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程屮如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10・20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程屮如有沉淀形成，应该

4、再次离心。3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(200()・3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。1.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS,PH7

5、.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持28C的温度。加入一定量的PBS（PH7.4）,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000・3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于・20°C保存，但应避免反复冻融.3.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100川，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液

6、50卩1,混匀；然后从第一孔、第二孔中各収100卩1分别加到笫三孔和笫四孔，再在第三、第四孔分別加标准品稀释液50川,混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50山弃掉，再各取50卩1分别加到第五、第六孔屮，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀；混匀后从第五、第六孔屮各取50卩1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50卩1,混匀后从笫七、笫八孔屮分别取50卩1加到第九、第十孔屮，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50卩1,混匀后从第九第十孔中各取50川弃掉。（稀释后各孔加样量都为50川，浓度分别为36ng/L,24ng/L,12n

7、g/L,6ng/L,3ng/L）o2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔屮先加样品稀释液40pl,然后再加待测样品10卩1（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37°C温育3（）分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸饰水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50）11,空白孔除外。7

8、.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。