低温诱导下黑龙江林蛙肝脏蛋白质电泳图谱分析

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1、低温诱导下黑龙江林蛙肝脏蛋白质电泳图谱分析孙雪玲王昊张晶饪柴龙会肖向红*（东北林业大学IT生动物资源学院，險尔»150040）摘要初步分析黒龙江林蛙肝脏蛊白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上的分布及低温诱导下黑龙江林蛙肝脏蛊白质的适应性变化.结果衣明：分离胶浓度为6%的肝脏蛋白质电沐图谱分辨率高、条带多，可分辨出15-19条带带；・2*C条件下Rf为0.79的责白含量较空温条件下的蛋白含锻有所增加（PV0.05）,而fifi机选取的两条保守蛋白带含最并无显若性差异.关權词黑龙江林蛙低温诱导肝脏蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电沐两栖类作为变温动物对环境的适应特性是物种在长期进化过程中逐

2、渐形成的。当环境温度降低到某一极限时，它们则会采取冬眠行为、生理、生化等策略降低自身的新陈代谢水平，以适应低温条件下的生存。黑龙江林蛙在分类地位上属于两栖纲Amphibian无尾目Anura蛙科Ranidae蛙亚科Raniaeo蛙属Ram⑴。主要分布于东北地区，为北方耐寒两栖类。该地区冬季漫长而寒冷，黑龙江林蛙为适应季节环境变化而釆取相应的抗寒对策。本文旨在研究低温诱导下黑龙江林蛙肝脏蛋白质的适应性变化，以探讨黑龙江林蛙冬眠期耐受低温的机制，也可为两栖类低温生物学和比较生理学的深入研究提供一定的参考依据。1材料与方法1.1材料及处理黑龙江林蛙，健康成年雄性，60只，采自黑龙江

3、省伊春地区，置4C冰箱中冬眠两个月。将黑龙江林蛙随机将蛙分为两组，室温组（14*030只和低温组（・2*C）30只。室温组置于14弋下复苏24h,低温组直接暴露于・2*C冰箱中诱导24h,记录两组林蛙的存活率。随后迅速取其肝脏置于液氮中，并将肝脏样品转移至•acre冰箱保存备用。1.2方法1.2.1样品制备：分别取室温组和组的黑龙江林蛙肝脏样品0.16克，加入500皿样品缓冲液研磨，49下10000r/min离心15min,取上清备用，用Amersham2100分光光度仪在280nm（A280）处测定蛋白质含量.1.2.2电泳，采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板连续系统，电泳缓冲液T

4、risCl（pH8.3）体系，凝胶浓度6%,交联度2.6%,胶板厚度1.5cm。取80憾样品，加入50pl样品缓冲液混匀，毎孔上样fi40gl.使用Amersham.EPS601电泳仪，初始电压15mA,样品进入分离胶后调至25mA。考马斯亮兰R-250染色。1.2.3数据处理：凝胶用Bio・Rad凝胶成像系统照相，用TotalLabv2005凝胶图像分析软件分析,SpsslO.O军计软件对蛋白谱带峰值进行分析，并作统计学表2・1不同温度放■黑龙江林蛙24h存活悄况处理。殛林鮭数■~性别「放置时何—存活数丽率（14DSTRS24h29R97%2结果低温组（-2C）30只雄24

5、h27只90%2.1两种溫度下黑龙江林蛙存活率比较结果显示（表2-1）,室温组的黑龙江林蛙存活率为97%,・2€组的存活率为90%,此外在・2匸组黑龙江林蛙体表可见冰晶，活动极为缓慢，断头处死，血液展很少，表明黑龙江林蛙对・2t低温环境有一定的耐受能力。推测黑龙江林蛙为适应低温条件而降低自身代谢率和循环血量，以减少能量消耗•基金项目，黑龙江省自然科学基金重点项目（編号ZJN0604-02）作者简介：王浩（1982-）.男，在读磧士研究生，主要研究方向*动物生理学通讯作者“肖向红教授•Tel:0451-82191673（办、传具）.手机，13836119220EmMl:xiao

6、xh・vip・0451.co■:xiaoxh2010®sina.com2.2TolaIabv2005图像分析软件分析黑龙江林蛙肝脏蛋白质电泳图WA:黒龙江林蛙肝脏蛋白质PAGE电泳图B:去除背最色的电泳0011图2-1黑龙江林蛙肝脏蛋白质PAGE图ii的分析（A:6%浓度分离胶PAGE图；B:去除背聂色的电泳图谱）反件分析结果显示（图2・1）,分离胶浓度为6%的月T脏电泳图谱分辨率高、条带多，可分辨出约15・19条区带，根据迁移率可划分为3个区.I区：（瓯=0.97、Rfb=0・95、Rfc=0.89）。a、b、c谱带染色非常浅。【I区：包括3条保守带（RS0.67、Rfe=

7、0.63、Rff,0.57）.d和e带窄而染色深；f带深而宽•Ill区:包括4条保守带（Rfg=0.42xRfh=0・36、Rfi=0・33、Rfj=0・24、Rfk=0.19>Rfi.0.10）.g带宽而染色深；h>i和1带细而窄，j和k带弥散而且染色深。在I区有一条谱带在有些个体中存在，而且染色深浅不均，TotalLlabv2005分析其峰值。2.3TotalLabv2005图像分析系统分析室溫和・2£下黑龙江林蛙肝脏誉白质谱带变化区域的峰值C:宣温和・29黒龙辽林蛙肝腿爱白质电泳图谱D:室週和・2