浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

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1、摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术己从单纯的实验操作扩展到牛命科学、牛物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略摘要1引言12基础理论概述12.1细胞培养的概念12.2原代细胞培养的概念12.3传代细胞培养23影响细胞体外培养的因素23

2、.1细胞分离方法23.1.1直接分离法33.1.2酶消化法33.2细胞培养温度33.3细胞培养基的成分33.3.1天然培养基33.3.2合成培养基33.4接种密度43.5培养基的pH值43.6细胞的冻存与复苏43.6.1细胞冻存43.6.2细胞复苏54细胞实验室无菌环境的防控策略54・1无菌室的彻底消毒54.2培养用品的清洗和消毒灭菌64.2.1清洗6422消毒灭菌64.3培养试剂的分装与保存74.4对操作者的要求75结语8参考文献9致谢10浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养

3、技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域己成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子牛物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。近年来，分子牛物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的

4、细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。2基础理论概述2.1细胞培养的概念细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。2.2原代细胞培养的概念原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下牛长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养

5、的最初和必经阶段。培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%月夷酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或休腔液，一般采用离心法分离细胞，低速500-1000r/min,离心5-10min即可。培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液屮，细胞就能增殖。2.3传代细胞培养传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器

6、皿屮，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。这些细胞一般可顺利传40・50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株。一般细胞原代培养1・4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。在细胞传代的过程中，有些因发牛遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞

7、称为无限细胞系/株。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40・60代；幼年20・40代；成年10・30代；得了早老病的儿童2・10代。传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落,或用EDTA溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。过滤除菌后小量分装，于・20°C保存。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的EDTA溶液与胰酶的混

8、合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37°C作用3-5min,加入Hanks液，1000i7min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积3影响细胞体外培养的因素3・1细胞分离方法细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括:直接分离法（包括机械法和ED