《细胞生物学技术》PPT课件

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1、细胞生物学技术★流式细胞术★WesternBlot★蛋白质芯片细胞生物学技术—流式细胞仪流式细胞仪（FlowCytometer，FCM)是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。流式细胞仪细胞生物学技术—流式细胞仪工作原理流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适

2、当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。如左图所示。细胞生物学技术—流式细胞仪流式细胞仪流动室和液流系统激光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统结构组成：除以下四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。细胞生物学技术—流式细胞仪流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组

3、成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱细胞生物学技术—流式细胞仪光电倍增管（PMT）光电管和检测系统细胞生物学技术—流式细胞仪光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光

4、电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节　，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性

5、关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。细胞生物学技术—流式细胞仪计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行

6、数据处理和分析，最后给出结果。细胞分选系统FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

7、细胞生物学技术—流式细胞仪数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图（Histogram）二维等高图3DPlot二维点图DotPlot细胞生物学技术—流式细胞仪优点：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。2、具有较高的灵敏度