禾本科植物内生真菌研究13禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组DNA的快速提取Reviewed

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1、禾本科植物内生真菌研究13：禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组DNA的快速提取摘要：调查了我国7省12个不同地区的禾本科植物的内生真菌，经分离、培养后鉴定冇印ichlog属1种和Neotyphodium属5种内生真菌。提取真菌基因组DNA主要是SDS法，但提取步骤繁琐月.耗时，难以用于人量样品的处理。本研究采用改良的QS(quickandsafe)法进行禾本科植物内生真菌基因组DNA的提取,并通过PCR进行验证。以生长在平板上的菌丝为起始材料，仪器要求简单、操作简便，快速安全、省时省力，整个提取过程大约40mine新方法和常规SDS法相比，时间缩短到2周，为原来的1/4。Z后

2、以采用改良QS法捉取的DNA为模板，检测禾木科植物内生真菌屮的NRPS基因，并在NCBI上BLAST比对。这种快速提取法所获得的基因组DNA质量高，可用于后续PCR、基因克隆及其它高通戢测试，特别适合获取人量真菌菌株基因组DNA时使用。关键词：禾木科植物内生真菌；某因组DNA的提取；NRPS；PCR扩增；序列比对Grassendophyteresearches13：isolationandrapidextractionofgenomicDNAforgrassendophytesAbstract:Endophyticfimgiweresurveyedin12diffcrcntre

3、gionsof7provincesinChina,1speciesofEpichloeand5speciesofNeotyphodiumwereidentified.SDSprocedureismainlyusedforextractionoffungalgenomicDNA.Buttheyaretoosophisticated,andtime-consumingtodealwithlargescalesamples.Inthisstudy,weusedimprovedmethodforgenomicDNAextractionfromslow-growingfungalendo

4、phytes・TheimprovedQSmethodwasachievedbyusingplate-grownmyceliaasthestartingmaterialandusingglassrodasatoolforsmashingthecellwall.Thisnewmethodwasinvirtueofsimpleequipment,easyoperation,rapidandsafeextraction,andlowcost.Thewholeextractionprocesscouldbeaccomplishedin40minutes.Ittook2weekswhich

5、was1/4ofSDSprocedures・ThenDNAwasusedastemplatetodetecttheNRPSgenesoftheendophytes・TheresultedsequenceswereblastedinNCBI.ThequalityofDNAsamplesfromthismethodcouldbeusedforsubsequentPCR,cloning,andotherhigh-throughputtestingrequirements,particularlysuitableforalargenumberoffungalstrains.Keywor

6、d:Grassendophytes;ExtractionofgenomicDNA;PCRamplification;Alignment禾本科植物内生真菌是生活于宿主植物体内的特异性真菌，一般在植物体内完成其生活史的部分或全部但不引起任何病症“刀。目前Epichloe属有11个种，Neotyphodium属有23个种阳】。我国地域广阔，禾本科植物资源丰富，从2004年至今，相继有多个新种被报道⑶。Epichloe属和Neotyphodium属的各种与各自的宿主植物之间具有比较严格的宿主特界性⑴。由于内生真菌对宿主植物具有强烈的生存依赖性，在离体培养条件下菌株的生长非常缓慢，这大大

7、的限制了对其生物学特性的研究。近年来，随着分子生物学技术的发展，内生真菌己经进入了利用其DNA片段进行基因水平的研究阶段。因此，如何能高效的获得内生真菌的基因组DNA成为当今的研究热点之一。真菌DNA的提取方法有很多，传统的真菌DNA提取方法来源于植物基因组DNA的提取⑹，包括以新鲜的菌丝作为起始材料、机械破壁以及反复的提纯。但缺点在于准备新鲜的菌丝体量多，培养时间反，占培养空间多，菌丝需冷冻处理，不适合大量样品的处理。此外,蛋白酶K、苯酚一氯仿等处理要求样品多次转换，DNA溶液中残余的蛋白