[园林植物育种学课件]-第8章分子育种

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1、第八章分子育种一、分子育种的概念与程序概念按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组技术和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系，亦即基因工程。2.植物基因工程植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。3.基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测4.观赏植物基因工程的目的基因1、观赏性开花、花色、花型、花径相关基因。2、抗逆性抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因3

2、、切花寿命4、花期调控二、基本技术及原理（一）DNA重组技术将外源DNA片段与载体分子连接，形成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。DNA重组技术（二）基因工程的基本概念1.转化（Transformation)：是指将外源DNA导入受体细胞的过程。2.复制子（Replicon)：具有一个复制起点(ori)的DNA分子称为一个复制子。3.载体（Vector）：能与外源DNA连接并实现转化的复制子。4.重组子（Recombinant）：连接了外源DNA分子的复制子。（三）基因工程的工具酶限制性内切酶（restrictionendonu

3、clease)DNA连接酶（ligase)末端修饰酶（五）基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子（标记基因）目的片段选择标记载体(六)植物基因工程的报告基因定义特点在选择培养基上生长报告基因与目的基因嵌和表达研究调控区报告基因的种类新霉素磷酸转移酶（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基因氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸转移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hp

4、t）基因β–葡萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因荧光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草剂（Basta,Bar）基因三、转基因操作的方法(一)外源DNA导入植物细胞的方法载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法外源DNA导入植物细胞的方法1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法2、病毒介导的基因转移3、基因枪介导的基因转化4、PEG诱导的基因转化5、脂质体介导6、电激法介导7、超声波介导8、显微注射9、激光微束10、种质系统介导基因转化法1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（

5、T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。根瘤农杆菌及Ti质粒Ti质粒根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。Ti质粒的功能为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；诱发植物产生冠瘿瘤；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；决定寄主范围。Ti质粒的结构T-DNA区Vir区Con区Ori区Vir区LBRBETiPlasmidT-DNA区Ori区Con区Vir区操纵子的基因结

6、构与功能Vir区是一段长度为35KB操纵子包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。核心区左边界右边界T-DNA的结构与功能∶LBRBLBRB植物遗传转化的载体系统一元载体（顺势载体）双元载体（反式载体）农杆菌介导的转化质粒的构建PG2TNOSAmprPG1T目的基因报告基因，选择标记基因Vir区目的基因报告基因，选择标记基因LBRB农杆菌导入方法共培养法叶盘转化法整株感染法原生质体共培养法2、基因枪介导的转基因操作基本原理操作步骤优点影响转化效率的因素Bio-RadBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystemBio-R

7、adBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystem操作步骤预培养转基因操作转基因植株筛选和培养转基因植株的鉴定田间释放影响转化效率的因素金属微粒DNA沉淀辅助剂DNA纯度和浓度微弹速度植物材料基因枪法的优点无宿主限制；靶受体类型广泛；可控度高；操作简便。问题：转化效率低；嵌合体多；稳定性差，瞬时表达；外源基因沉默；整合机理不详。3、PEG诱导的基因转化聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷酸钙在高PH值条件下诱导原生质体扑获DNA分子。步骤：共保温；稀释PEG；非选择培养；选择培养。优点：转化顺利，