ELISA实验可能出现的问题及原因分析

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1、ELISA实验可能出现的问题及原因分析1•应该注意试剂4。c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常；2•标本由于冷藏时IgG聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损；3•加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜；4•常采用的温度有43、37°c、室温、或者4。c等。37°c最常用，4°c效果最好，但孵育时间有异；5•要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等；外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。6、在使用ELISA

2、试剂盒时应注意：2-8°C保存（特殊情况除外）、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。常见问题及分析1阳性对照不显色漏加阳性对照阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂阳性对照受污染2、阳性对照显色浅（HBeAbHBcAb阴性对照显色浅）试剂和保存不当、活性下降在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育时间不够或孵育温度过低洗板浸泡时间过长、洗板次数过多使用不正确的洗液洗液中含有防腐剂同时残留量过多洗板后酶标板被干透读数时使用波长不正确滤光片不清洁或滤光片位置错误读数时酶标板放置位置错误阳性对照活

3、性下降酶标失活3、阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）实验过程受污染阴性对照污染酶滴在孔壁上4、整板不显色试剂和保存不当、已经失活忘记加酶、可检查滴瓶内酶量忘记加抗原或中和试剂忘记加显色剂A或显色剂B5、阳性对照读数不正常加入标本后未进行必要的混匀标本稀释错误加样量不正确冷冻标本未完全溶解混匀标本中含有防腐剂6、血清本底高试剂盒灵敏度高加样时使用同一枪头、交叉污染孵育时间过长或温度过髙洗板次数不足，浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔洗板机管道中有霉菌生长洗液瓶混用洗板机洗

4、板头阻塞或洗板机洗板头位置错误配置洗液的去离子水或蒸馅水被污染终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染读数时酶标板底部有水蒸气凝结酶标仪偏差7、假阳性结果实验器具被污染血清中出现纤维蛋白凝集血清标本中出现过多的红细胞血浆标本处理不当标本中含有灰尘、颗粒或细菌等标本被反复冻融加标本后进行不正确的振荡沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净混用洗液或洗液稀释错误洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌洗板次数不足或浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔读数时酶

5、标板底部有水蒸气凝结洗液瓶、废液瓶混用读数过程中板孔中有气泡酶标仪偏差8、同一板内重复性差标本混匀不充分试剂混匀不充分标本与酶结合物混匀不充分加样技术差异加样器故障或加样器被污染加样时间过长导致孵育时间不同孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异读数时酶标板孔间有气泡9、HCV血清本底高灵敏度髙样本稀释液加液量不足lOOul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多(>10ul)同一孔加了两次样本10、HIV阳性对照低误将阳性对照稀释阳性对照未混匀加液量不足11、HIV血清本底高标准

6、变更，灵敏度提高标本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多(>10ul)同一孔加了两次样本