基因工程基本操作程序知识总结

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1、基因工程操作程序知识总结H的基因：指编码蛋白质结构基因厂基因文库「基因组文库r从基因文库中获取£目的基因的获取）方法ji部分基因文库]L人工合成PCR：是一项在生物体外复制特定JDNA片段的核酸合成技术。利用PCR技术扩增目的基因J目的：获取大量的目的基因原理：DNA复制1过程「目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，基因表达载体的构建I并使0的基因能够表达和发挥作用。（基因工程的核心）]1=1的基因：启动子:基因表达载体的组成f目的基因：＜终止子：标记基因：r转化：冃的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程俨杆菌转化法「导入植物细胞

2、的方法：q基因枪法将冃的基因导入受体细胞J方法：压粉通道法I导入动物细胞的方法：显微注射技术J导入微牛:物的方法：检测转基因生物的染色体上是否插入了口的基因检测：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因「方法：分了杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA）n的基因的检测和鉴定f检测H的基因是否转录、方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA）检测目的基因是否翻译成蛋口质方法：抗原一抗体杂交外显子与内含子鉴定：对生物进行个体水平的鉴定—•般來说，结构基因都是由外显子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系不是完全固定不变的。有时同一条DNA链上的某一段DNA序

3、列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因吋，则是内含子，结果是同一•基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNAo2.原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点原核细胞的基因真核细胞的基因不同点编码区连续；结构简单编码区有间隔，不连续；结构复杂相同点都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息表达的核昔酸序列；编码区上游都冇与RNA聚合醜结合的位点考点梳理（一）DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶一一“分子手术刀〃（1）主要是从原核生物屮分离纯化來的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核廿酸序列，并能将每一条链上特定部

4、位的两个核廿酸之间的磷酸二酯键切开。（3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA,切口是平末端。2.DNA连接酶一一"分子缝合针〃（1）DNA连接酶的分类:E.CO//DNA连接酶和T4DNA连接酶。（2）作用及作用部位：E.co/zDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。3.运载体（运输工具）：质粒、噬菌体和动、植物病毒等（1）必备的条件：①能在受体细胞屮复制并稳定保存；②具冇一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择

5、；④对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。（2）常用运载体一一质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNAZ外的，具有H我复制能力的小型环状DNA分子。（二）基因工程的棊木操作程序1.冃的基因的获取：①直接从生物体中提取总DNA,构建某因组DNA文库，从中调用目的慕因；②以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；③利用聚合陆链式反应（PCR）特界性地扩增所需要的目的基因片段；④化学合成。获得原核细胞的冃的基因町采取直接分离，获取真核细胞的冃的基因一般是人丄合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核牛:物有内含子，在转录时要被剪切掉才能纶成成

6、熟的mRNA,动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。2.基因表达载体的构建一一重组质粒的构建（1）表达载体的组成：复制原点+R的羞因+启动了+终止了•+标记基因①复制起始位八（即控制复制起始的位点。原核牛:物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子冇多个复制起始位点。②启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驳动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录③终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录①目的基因中的标

7、记基因最少耍有2个，1个是川來检测运载体是否进入了受休细胞，另一个是用来检测冃的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明1=1的基因己进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。（2）构建步骤：①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。②用，产生相同的黏性末端。③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切II处，再加