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1、实验室常用试验方法总RNA的提取（Trizol法提取〉在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于・80°C冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1.提取组织RNA时，每50〜lOOmg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10X106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述
2、组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15〜30C下放置5分钟;3.在上述EP管中，按照每lmlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15°C〜30°C）放置2〜3分钟后,12000g（2°C~8°C）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每lmlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15°C〜30°C）放置10分钟,12000g（2°C〜8°C）离心10分钟;5.弃上清，按照每lmlTRIZOL加1ml7
3、5%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2°C~8°C）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。PCR实验室常用DM聚合酶有三种：TaKaRaTaqTM,TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymeraseoTaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增
4、得到的PCR产物3'端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方ReagentQuantity,for50)li1ofreactionmixture10XPCRbuffer(Mg2+fre
5、e)5
6、ilMgC12(25mM)如TaKaRaTaqTM力口3卩1如TaKaRaEXTaqTM加4卩12.5mMdNTPmix4pl10
7、iMPrimer上游1
8、il10pMPrimer下游1plTemplateDNA1ITaq或EXTaqDNAPolymerase0.25plSteriledeionizedwaterUpto50
9、ilTotaI50(il/SampIePyrobestTMDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50
10、nlofreactionmixt
11、ure1OXPyrobestbuffer5
12、il2.5mMdNTPmix4)il10
13、iMPrimer上游10
14、iMPrimer下游1)ilTemplateDNA1plPyrobestTMDNAPoIymerase0.25plSteriledeionizedwaterUpto50p1TotaI50
15、i1/Samp1e①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50卩1以节约试剂；②将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；③如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~
16、50卩1的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发：2.按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote起始变性94〜951-31变性94〜950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C,再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸lOOObp最终延伸70-75101反应结束后，抽取扩
17、增样品5(11,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。TOP2RT-PCRProtocol:TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity,for50plofreactionmixture1OxOneStepRNAPCRBuffer5pl25mMMgC1210pl10mMdNTPmix5plRNaseInhibitor(40U/pl)卽IAMV-
