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时间:2017-11-29
《dd人乙酰肝素酶 (hpa) 酶联免疫分析试剂盒 使用说明书》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、人乙酰肝素酶(HPA)酶联免疫分析试剂盒使用说明书产品编号:E0711hwww.eiaab.cn本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中乙酰肝素酶(HPA)含量。实验原理用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗HPA抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗HPA抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HPA呈正相关。用酶
2、标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板:一块(96孔)2.标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为100U/L,做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释成100U/L,50U/L,25U/L,12.5U/L,6.25U/L,3.12U/L,1.56U/L,样品稀释液直接作为标准浓度0U/L,临用前15分钟内配制。如配制50U/L标准品:取0.5ml(
3、不要少于0.5ml)100U/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。3.样品稀释液:1×20ml。4.检测稀释液A:1×10ml。5.检测稀释液B:1×10ml。6.检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。7.检测溶液
4、B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8.底物溶液:1×10ml/瓶。9.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10.终止液:1×10ml/瓶(2NH2SO4)。11.覆膜:5张12.使用说明书:1份自备物品1.酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)2.微量加液器及吸头,EP管3.蒸馏水或去离子水,全新滤纸标本的采集及保存1.血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放
5、于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本:请1000xg离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。操
6、作步骤实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使
7、用新的标准品溶液。2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。6.依序每孔加底物溶液90
8、μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后立即进行检测。注:1.试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一
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