生物芯片入门(四)

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1、生物芯片入门（四）：基因表达谱芯片实验操作2（荧光，扫描仪,微阵列，生物芯片）互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测,杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间（往往要求过夜），但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的待异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内（儿小时）、低盐、髙温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核葫酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸,在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点

2、的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。杂交反应还必须考虑杂交反应体系屮盐浓度、探针GC含暈和所带电荷、探针与芯片Z间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症（cancer）研究院的JorgHoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身攵性。由

3、于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品。对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：1.Clontech公司的AltasGlassMicroarrays,产品已经包含GlassHyb?HybridizationSolution和GlassHyb?WashSolution,能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的AltasGlassHybridizationChamber,旋盖式的设计和1.8ml的容积,避免了传统coverslip式

4、杂交盒的弊端。可以单独购买。7899-1AltasGlassHybridizationChambereach8016-1GlassHyb?HybridizationSolution50ml2.ClontechExpressHybHybridizationSolution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNAArray>Southern>Northern>菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarrayo在这些系列的产品中均

5、配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。8015-1ExpressHybHybridizationSolution250ml8015-2ExpressHybHybridizationSolution500ml3.对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种GlassArray杂交缓冲液。SlideHyb?GlassArrayHybridizationSurveyKit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNAArray优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很

6、难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒屮提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买,连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。Cat.No.ProductNameSize1860SlideHyb?Glas

7、sArrayHybridizationSurveyKitlOOrxns8861SlideHyb?GlassArrayHybridizationBuffer#l5x2ml8862SlideHyb?GlassArrayHybridizationBuffer#25x2ml8863SlideHyb?GlassArrayHybridizationBuffer#35x2ml8864SlideHyb?GlassArrayHybridizationBuffer#45x2ml10040GlassArrayHybridizationCassette1each1.Ambi

8、on同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和WashBuffer,精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背