资源描述：
《气泡上升法测定生物活性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、气泡上升法测定生物活性溶液配制：磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠(含2出0)1.79g,磷酸氢二钠7.10g,叠氮化钠0.20g,吐温一80O.lg,加水至WOOmLo人凝血酶溶液：取人凝血酶，加磷酸盐缓冲液制成每ImL中含33U的溶液。人纤维蛋白原溶液：取人纤维蛋白原，加磷酸盐缓冲液制成每ImL含可凝蛋白2mg的溶液。人纤维蛋口溶酶原溶液：収人血纤维蛋白溶陆原，加磷酸盐缓冲液制成每ImL含Img的溶液。混合溶液：临用前取等体积的标准品溶液或供试品溶液与人凝血酶溶液，混匀，置冰浴屮。标准品溶液的制备：取t-
2、pa国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每ImL中含850,425,213,107,54,27IU的溶液。供试品溶液的制备：取待标定的样品同标准溶液配制。测定法：取试管6支，加人血纤维蛋口溶酶原溶液20ul与人纤维蛋口溶液lml,混匀，g冰浴中,依次加不同单位的混合溶液200ul,立即摇匀,并置(37±0.5°C)水浴屮，分别计时，反应系统应在30秒内凝结，当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点，计时，以「ht-pa浓度的对数作为横坐标，以反应时间(秒)的对数作为纵坐标，进行线性冋归，其相关系数不
3、得低于-0.990o同法测定供试品溶液。备注：组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)和重组型纤维蛋白溶酶原激活物(rt-PA)带有表达质粒pBV220/PAI-l的大肠杆菌中，在菌体密度为A600nm二0.3-0.4时诱导，表达重组PAI・l(rPAI・l)的效率最高。在诱导后的6h以内，rPAI-1的百分含量持续升高。rPAM经分离纯化并用盐酸脈激活后，能够与t・PA及u・PA反应，用SDS・PAGE和纤维蛋白自显彩方法可以检测出它们所形成的复合物。比活测定(1)试剂牛纤维蛋白原溶液取牛纤维蛋白原，
4、加巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)制成每1ml中含6.67mg可凝结蛋口的溶液。牛凝血酶溶液取牛凝血酶，加巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)制成每1ml屮含6.0单位的溶液。牛纤维蛋白溶IW原溶液取牛纤维蛋白溶液酶原，加三轻甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)制成每1ml中含1〜1.4酪蛋白单位的溶液(如溶液浑浊，离心，取上清液备用)。混合溶液临用前取等容积的牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。⑵标准品溶液的制备取尿激酶标准品，加巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)制成每1ml中含60单位的溶液。(
5、3)供试品溶液的制备取本品适量，用巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解、混匀，并稀释成与标准品溶液相同的浓度。⑷测定法取试管4支，各加牛纤维蛋白原溶液0.3ml，置37°C±0.5°C水浴中,分别加入巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)0.9ml、0.8ml、0.7ml、0.6ml,依次加标准詁溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml,再分别加混合溶液0.4ml,立即摇匀，分别计时。反应系统应在30〜40秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，记时。以尿激酶的浓度为横坐
6、标，以反应终点时间与入水浴吋间的差值为纵座标，在双对数纸上绘制标准曲线，应呈直线。供试品按上法测定，在标准曲线上求得效价（单位）。标准品和供试品各作二次，所得的直线亦应平行，否则应重复试验。蛋白质含量取本品约10mg,精密称定，照氮测定法（附录VDD第二法）测定,将结果乘以6.25,即得供试品中蛋白含量，并计算每1mg供试品中的蛋口量（mg）o比活按下式计算比活。每1mg供试品的效价（单位）比活=每1mg供试品中蛋口量（mg）纤维蛋白块溶解时间法（体外凝块裂解气泡上升法）此法简称CLT法。纤溶酶、tP
7、A.UK等溶血栓物质都以此方法來测定活性。测定NK活性的方法就是根据以上齐种方法稍加变动而建立的[9]o0°C下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37°C恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止吋，作为纤维蛋白溶解时间（CLT）。同样以标准K或UK或纤溶酶作为标准品，以CLT对NK浓度的对数作图，发现在10〜70ug范围内有很好的线性关系。比较于平板法，CLT法迅速快捷，冇较大的分辨率，且更适于粗酶的活性测
8、定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计吋装置，否则同吋测定多个样甜是比较困难的。简称CLT法纳豆激酶的测定方法冇五种：纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法、酶联免疫吸附法。纤维蛋白平板法：该法参照Astrup（1952）的方法，并进行了一定的改进。将纤维蛋白源溶液、凝血酶溶液按一定比例倒入无菌平血中，小心振荡摇匀，室温凝固制成平板。在平板上分别点样纳豆激猶、尿激猶，37°C孵育18h后，测量纳豆激酶相
