微生物工程-03微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏

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1、微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏方法一、代谢调控育种MetabolicControlBreeding1.营养缺陷型突变株(auxotrophmutant)•酶缺陷，结果造成中I'可产物积累；•解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；•渗漏型突变(酶未完全丧失活性，下降)，末端产物少，中间产物积累。2.抗反馈调节突变株(regulationdefectivemutant)突变株筛选•调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；•结合，但不发生作用；•结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养

2、缺陷型回复突变株筛选.3.组成型突变株(constitutivemutant)筛选•突变发生在调节基因或操纵基因，解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。•筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法4.抗(敏感)性突变株(resistantmutant)筛选•包扌心抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染③条件抗性突变：如温度，可提高产量④物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。二、基因重组育种(gene

3、recombinationbreeding)基因重组育种的定义：是指采用接合、转化、转导、原生质体融合、有性朵交及准性生殖等遗传学方法和技术，使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。(P24第2段)1.原核生物的基因重组育种(1)接合(conjugation)定义；大肠杆菌的4种不同接合型菌株：FFHfr菌株和F菌株(2)转导(transduction)转导、转导子(twnsductant)、转导噬菌体(3)转化(transformation)转化、转化子(transfor

4、mant)、感受态(competence)2.真核微生物的基因重组育种主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。3.原生质体融合(protoplastfusion)定义：原生质体融合(protoplastfusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。（P26）优点P26,5条主要操作步骤：原生质体制备、原生质体融合和再生、融合子的选择制备原生质体时，

5、细菌主要用溶菌酶和青霉素，酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、儿丁质酶或纤维素酶；融合过程多采用聚乙二醇（PEG）作为融合剂，并加入Ca?+和Mg?+等阳离子；营养缺陷型标记选择是常用的融合子选择手段。1.基因工程育种（GeneticEngineeringBreeding）定义：是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。（P27第3段）操作流程主要包括：目的基因的分离或合成、载体的选择与准备、目的基因与载体DNA重组、重组载体导入受体细胞、重组菌的筛选和鉴定。P2

6、7图2-1三、菌种的退化、复壮与保藏1.菌种的退化（straindegeneration）菌种退化是指由于自发突变的结果，使菌种原有的一系列生物学性状发生改变的现彖。、主要表现在：（1）细胞形态和菌落特征改变；（2）生长速率变慢；（3）生产性能下降;（4）坏境适应能力减弱。菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。不适宜的培养条件，以及较多的传代次数都会导致菌种退化。防止退化的主要措施：（1）尽量减少传代次数；（2）利用不退化的细胞（比如放线菌和霉菌的孑包子）传代；（3）创造良好的培养条件；（4）采用有效地菌种保藏方法。2.菌种的复壮（rej

7、uvenation）概念P28菌种复壮的主要方法：（1）纯种分离筛选（2）通过寄主体复壮（3）淘汰已衰退的个体3.菌种保藏spawnpreservation各国的菌种保藏机构（typeculturecollectioncenter）：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国典型培养物保藏中心（CCTCC）,美国典型菌种保藏中心（ATCC）,美国农业部北方地区研究:实验室（NRRL）,德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）,荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）,英国国家典型菌种保藏中心（NCTC）,日本大阪发酵研究所（IFO）常用的菌种保

8、藏方法：方法措施保存期优缺点斜而保藏法(routineslanttransplantationmethod)斜而，4°C冰箱低温保存3-6个月简便；短期过渡穿刺保藏法(stabsemisoli