【11】手把手教你入门“有关物质”

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1、手把手教你入门“有关物质”[11]手把手教你入门“有关物质”原料药中的杂质包括有机杂质（工艺和药物相关的）、无机杂质和残留溶剂。其中有机杂质就是一般我们所指的有关物质，是指在药物生产过程/贮存中所引入/生成的起始物料、中间体、副产物、异构体、降解物、催化剂等1；药物制剂的有关物质主要是指药物自身的降解物以及药物与辅料或包装材料相容性产物等2。有关物质可能会具有不确定的毒性，甚至潜在的致癌、致畸、致突变等性质，因此需严格控制。国内外药典中很多品种有关物质检测方法通过峰面积比较的方法来确定是否符合规定，这种方法忽略了供试品溶液和

2、对照品溶液的实际浓度，是一种限量检测的方法。但这种限量方法有相当的局限性：一是忽略了实际浓度会导致测定数据的准确性降低，二是无法统计出有关物质的稳定性变化趋势和样品的批间差异。越来越明显的趋势表明，国外更多的品种正以定量的检验方法来代替限量的检验方法，本文的目的就是以定量的方法来说明有关物质检验方法的建立、验证和检验的要求。由于药物和有关物质本身一般都是有机物，且具有相类似的化学结构，因此具有专属性（稳定性指示性）和准确性高的HPLC法就作为了有关物质检验的首选方法。本文将针对HPLC法检验有关物质方法的建立、验证和检验与大

3、家作一个探讨。一、有关物质检验方法的建立首先需要说明的是，任何一种检验方法都不可能是万能的，HPLC法也是一样，一般有两个大的缺陷：一是HPLC检验的图谱不是一个“全谱”，也就是说一个HPLC方法并不会像TLC方法一样把所有的杂质都会同时检验出来，尤其是国内现在使用较多的恒流的色谱方法，极性相差较大的化合物很难在一个色谱条件下检出；二是有一些杂质在检验条件下没有响应，例如一些化合物的原料/中间体/副产物没有紫外吸收，使用紫外检验器是无法检验到的。因此在建立有关物质的检验方法时，往往需要针对不同的已知杂质建立特定的检验方法，作

4、为有关物质检验方法的补充，这个方法即可能是HPLC法，也可能是TLC法，甚至可能是紫外法或滴定法等等，需要说明的是，对于此类杂质在总杂质计算中不应被重复计算。有关物质HPLC检验方法在建立时需考虑到在该色谱条件下是否所有潜在的杂质都能被检出、各杂质的响应值是否合适、有关物质与含量之间的质量守衡（MassBalance，即理论上含量降低多少有关物质就应该增加多少）。很多人在有关物质检验方法建立时参考的是含量测定的方法甚至是血药浓度测定的方法，往往这是不合适的，因为这些方法都是针对主成分的测定方法，它不会去考虑杂质的检出情况和准

5、确性，只需要不干扰主成分的测定即可，而且往往在含量测定的浓度下杂质不能够检出，因此无论是流动相的组成还是检验波长，可能都不适合有关物质的测定。由于制剂有关物质的检验重点是降解物和相容性产物，因此原料药生产工艺杂质（包括原料、中间体、副产物等），如果不是降解物的话，都不是制剂有关物质重点关注的内容，在制剂质量标准中甚至可以不订入2。因此制剂有关物质的检验方法很可能与原料药会有所不同，这时需对原料药中可能存在的工艺杂质进行重新定位，这也是方法建立和专属性验证的一部分。有关物质HPLC检验方法的建立主要有四个关键点：色谱柱的选择、

6、流动相的组成、检验条件的选择、杂质测定的方法。下面我将从这四点出发说明有关物质是如何建立的。1、色谱柱的选择根据主成分和杂质的化学性质，选择合适的色谱柱，使其能够尽可能在一个色谱条件下检验所有杂质。在选择时往往极性强化合物选择极性色谱柱、极性弱的化合物5/5手把手教你入门“有关物质”[11]选择非极性色谱柱，但由于成本和环保的原因，除极性非常强的化合物外（例如糖），一般我们首选非极性色谱柱（例如C18）。即使相同类型的色谱柱，由于品牌、规格、型号等差异，色谱柱的保留行为可能会有很大差异，因此在检验时应尽可能固定这些参数。2、

7、流动相的组成流动相的组成往往取决于色谱柱的选择，在色谱柱选定后，通过调节流动相中各组分的比例、pH值、缓冲盐（包括离子对）的种类/浓度等条件，使主成分和杂质能够分离并在一个条件下检验，必要时应使用梯度。缓冲盐，特别是离子对试剂，各厂家的质量差别比较大，因此在使用时应尽可能使用固定的可靠的品牌。3、检验条件的选择选择合适的检验器是有关物质检验的一个重点，各种类型的检验器都有各自的优缺点。例如紫外检验器的优点是成本低、适用性广、操作简单，缺点是紫检验器为非质量型，各杂质和主成分的响应值可能会差别非常大；而蒸发光散射检验器的优点为

8、它是质量型检验器，各杂质与主成分的响应值比较接近，缺点是价格比较高、非挥发性流动相不能使用、检验结果非线性。作为最通用的紫外检验器，有关物质检验波长的选择非常关键，这一方面决定了是否所有潜在杂质能够检出，同时也决定了检验时是否可以采用主成分对照的方法测定（本文中所说的对照既可指主成分对照品