PCR技术及其应用-张静

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1、第八章PCR技术及其应用前言PCR技术简史第一节PCR技术原理和工作方式第二节PCR产物的克隆第三节PCR扩增未知DNA片段第四节与反转录相关的PCR（自学）第五节PCR产生DNA指纹（自学）第六节实时定量PCR前言PCR技术简史链式反应：chainreaction核链式反应：指能自持进行的原子核反应。DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。1971年，Khorana(霍拉纳)提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA

2、基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长设想ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGA

3、CCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis(穆利斯)等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶1989年美国《Science》杂志列

4、PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环一、PCR的基本原理第一节PCR技术原理和工作方式TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576

5、301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon二、PCR反应体系缓冲液脱氧三磷酸核苷(dNTPs)引物模板耐热性的DNA聚合酶131缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0，厂商提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，厂商提供，使用浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。M

6、g2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜。2.解链温度(Tm值)直接决定了退火温度(Ta值)的高低。两条引物间的Tm值越接近越好。3.避免引物内部出现二级结构。3、引物使用浓度为0.1-0.5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，P

7、CR特异性下降。4.要避免引物自身或引物间特别是3’末端碱基序列互补。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高。7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4、模板单、双链DNA均可。模板纯度不高（混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类）往往是限制PCR扩增的重要因素

8、。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果。不同属性的模板所加的理想的量不同。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。5、耐热性的DNA聚合酶均从耐热性的细菌中分离出来，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’