登革热检测方法

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1、附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体　　试验材料：　　（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；　　（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；　　（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；　　（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；　　（5）荧光显微镜。　　检测步骤：　　（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。　　（2）取出抗原片，

2、用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。　　（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。　　（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。　　（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。　　（6）荧光显微镜观察结

3、果。　　结果判断：　　细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。　　检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。　　意义：　　阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义；　　恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。　　附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA）　　检测单份和/或双份血清IgG抗体　　试验材料

4、：　　（1）抗原：　　阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。　　阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。　　（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；　　（3）缓冲液：　　包被液：pH9.6碳酸缓冲液；　　稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶）　　洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；　　（4）显色液：A/B液　　（5）终止液：4NH2SO4　　（6）酶标板、酶标仪。　　检测步骤：　　（1）用包被液按工作浓度稀释抗原，100μl/孔，4℃过夜

5、；　　（2）弃去包被液，用PBS-T重复洗涤3～5次，甩干；　　（3）将待检血清用稀释液从1：100开始作2或4倍连续稀释，加入抗原孔，100μl/孔，同时设阴、阳性对照，37℃水浴1小时；　　（4）弃去血清，用洗涤液洗涤5～6次；　　（5）加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，100μl/孔，37℃水浴1小时；　　（6）弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；　　（7）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；　　（8）加终止液于每反应孔，100μl/孔。　　结果判断：　　于

6、450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgG抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）　　意义：　　阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：100有诊断参考意义；　　恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。　　附件3：IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体　　试验材料：　　（1）抗原：　　阳性抗

7、原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。　　阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。　　（2）抗人IgM（μ链）单克隆抗体或多克隆抗体；　　（3）登革病毒IgM阳性、阴性对照血清；　　（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；　　（5）缓冲液：　　洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；　　稀释液：pH7.4PBS（5％牛血清）；　　封闭液：pH9.6碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；　　（6）显色液：A/B液　　（7）终止液：4NH2SO4　　（8）酶

8、标板、酶标仪。　　检测步骤：　　（1）用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过夜；　　（2）弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；　　（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。　　（4）将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；　　（5）弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型