毛细管电泳原理及分析策略

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1、欢迎各位老师同学参加贝克曼库尔特公司毛细管电泳交流会（广州）2008年7月11日华南师范大学日程安排11日：毛细管电泳原理及分析策略实验常见问题及分析仪器使用注意事项软件操作12日（Optional）：仪器、实验现场操作毛细管电泳分离原理及分析策略张鹏产品经理13916689097Peng_zhang@beckman.com美国贝克曼库尔特公司CE分离原理-与模式有关毛细管区带电泳（CZE）毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（cIEF）亲和毛细管电泳（ACE）毛细管电

2、色谱（CEC）第一章毛细管区带电泳样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快进样方式压力进样电动进样浓缩进样毛细管种类非涂层毛细管（裸管）内壁涂层毛细管（涂层管）非涂层毛细管-电渗流的概念-H+高pH低pH电渗流的特点EOF-+纯电泳状态-+EOF电泳+电渗流0tm(min)电渗流的作用电渗流的活塞流特点HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgiv

3、esplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzoneHydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone电渗流的活塞流特点电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用正面作用增加分离速度使得正、负电荷物质同时分离负面

4、作用减少分离时间和分离有效距离电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性影响电渗流的因素pH值pH越高，电渗流越大离子强度离子强度越高，电渗流越小缓冲溶液添加剂离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随pH的变化情况控制电渗流的三个重要手段采用涂层毛细管，消除电渗流的影响改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电渗流很低；当pH>10以后，电渗流基本不增加添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用缓冲溶液的影响和选择在CE中应

5、该根据以下性质来选择缓冲溶液：在所选的pH范围内有较强缓冲能力；在检测波长处有低的紫外吸收；小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris,borate,CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的CE缓冲体系磷酸钠体系宽缓冲范围硼酸钠体系高pH范围Tris-HCl体系低pH范围醋酸-醋酸铵体系CE/MS常用体系CZE分离条件的选择毛细管类型--涂层还是非涂层

6、？毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？缓冲液体系--种类和pH值添加剂类型--甲醇

7、环糊精

8、乙腈检测器选择--紫外

9、二极管阵列

10、激光诱导荧光缓冲溶液的选择可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。缓冲溶液及pH值的选择研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常

11、在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。缓冲溶液及pH值的选择pH的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。缓冲溶液及pH值的选择在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而

12、增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。缓冲溶液及pH值的选择缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.