westernblot流程-经典版

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1、1培养细胞总蛋白的抽提1)将代测细胞标准条件下培养48h，PBS洗涤2次，用细胞刮匙轻轻将细胞从培养瓶中刮下，收集细胞总量1×107个。1500rpm离心10min，弃上清。2)PBS洗涤2min×3，每次1500rpm离心10min，弃去上清。3)150μl三去污细胞裂解液重悬细胞，冰上静置30min。15000rpm离心30min弃去沉淀，细胞总蛋白即在上清液中。三去污细胞裂解液的成分：50mMtris-HCl,pH8.0,150mMNaCl,0.5%去氧胆酸钠1%NP-400.1%SDS1mMEDTA100μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)（临用前配制）10U/mlaprot

2、inin（临用前配制）4)将蛋白定量、分装。细胞总蛋白经BCAProteinAssayReagentKit定量后分装保存。Westernblot检测（ECL法）1）SDS-PAGE（凝胶）电泳：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。取15μl样品液和3μl6×加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。SDS-PAGE的配制成分分离胶(12%)浓缩胶(5%)去离子水1.6ml1.8ml3%AA母液2.0ml0.3ml1.5MTris-HCl(PH8.8)1.3ml--1MTris-HCl(PH6.8)--0.7

3、5ml10%SDS50μl30μl10%过硫酸胺(APS)50μl50μlTEMED5μl5μl总体积5ml3ml2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上(SDS-凝胶位于负极，硝酸纤维素膜位于正极)，0.3A恒流电泳80min。3）封闭：转膜结束后，取下硝酸纤维素膜，PBS浸泡5min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1h。已转膜的凝胶用考马斯亮蓝染液染色1h，脱色液脱色30min，观察胶上残留蛋白情况，判断转膜效率。4）一抗孵育（带有辣根过氧化物酶）：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入目

4、的抗体(1%MPBS按试剂盒要求稀释)，4℃摇动下过夜。5）二抗结合：PBS-T快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10min×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的相对于一抗的第二抗体(1%MPBS按要求比例稀释)，室温下孵育1h。PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。6）ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，于显影液、定影液中冲洗照片，观察结果。