课件基因工程的基本操作程序

《课件基因工程的基本操作程序》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第二节基因工程的原理和技术问题：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？1获得人的胰岛素基因——目的基因的获取①将目的基因转移入大肠杆菌（1）将人的胰岛素基因拼接到大肠杆菌的质粒中——形成重组DNA分子②（2）将重组质粒导入到大肠杆菌中？——将重组DNA分子导入受体细胞③（3）人的胰岛素基因导入成功了吗？——筛选含有目的基因的受体细胞④大肠杆菌能合成人的胰岛素——目的基因的表达⑤获取重组导入检测表达一、目的基因的获取（获得人的胰岛素基因）DNA的粗提取1、从基因文库中获取目的基因：(通常在未知DNA序列的情况下)基因组文库的构建：cDNA文库的建立：基因文

2、库：基因组文库：包含该生物的所有基因。cDNA文库：包含该生物的部分基因。一般针对基因的编码区而建立。2、体外直接合成目的基因(通常在已知DNA序列的情况下)①利用PCR技术扩增目的基因变性退火延伸APCR全称为_________________。C条件：____________________、__________、_______________________、____________。B原理：__________D结果：_____________________________________________________聚合酶链式反应DN

3、A复制已知序列的目的基因四种脱氧核苷酸三磷酸一对引物DNA聚合酶使目的基因短时间内呈指数方式扩增E过程：________________________________________________高温变性、低温退火、中温延伸由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列②　利用DNA合成仪化学合成合成较小的基因（不超过几十个碱基）例：核酸分子杂交的探针，PCR扩增的引物等。DNA合成仪②　利用DNA合成仪化学合成运载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组运载体运载体自连目的基因自连AATTCG目的基因AATTCGGCTTAAGCTTAAG

4、AATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG二、形成重组DNA分子（将人的胰岛素基因拼接到大肠杆菌的质粒中）重组DNA分子一定能使目的基因表达吗？重组DNA分子的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点参与的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶二、形成重组DNA分子三、将重组DNA导入受体细胞（将重组质粒导入到大肠杆菌中）导入微生物细胞：用Ca2+处理受体细胞，将重组DNA与之混合；导入植物细胞：土壤农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等导入动物细胞：对受精卵进行显微注射、胚胎干细胞技术、精子载体法等土壤农杆菌法花粉管通道法基因枪法例

5、：用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物细胞，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过培养形成愈伤组织，最后发育成转基因植物。目的基因导入动物细胞如：显微注射法动物细胞受精卵显微注射法例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。同样方法可获得疫苗、生长激素等。四、筛选含有目的基因的受体细胞（人的胰岛素基因导入成功了吗）DNA分子杂交技术：抗药性筛选法：互补显色筛选法：原核营养缺陷性筛选法：载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的

6、是导入成功的受体细胞。五、目的基因的表达（大肠杆菌能合成人的胰岛素吗）1、分子水平检测：检测转基因生物的DNA是否插入目的基因（即检测导入是否成功）检测目的基因是否转录出了mRNA：——分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质：——提取蛋白质、抗原-抗体杂交2、个体水平检测：检测性状总结：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因（和质粒载体）；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞（Ca2+），用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大

7、量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。