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1、第21卷第2期分析科学学报2005年4月Vol.21No.2JOURNALOFANALYTICALSCIENCEApr.2005文章编号:1006-6144(2005)02-0210-05pH荧光探针的研究进展*苏美红,聂丽华,马会民(中国科学院化学研究所分子科学中心,生命分析化学实验室,北京100080)摘要:本文评述了近二十年来荧光素类、半萘酚罗丹荧类、金属配合物类、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸盐等pH荧光探针的发展。按种类分别讨论了其荧光随pH变化的性质、适用的pH测定范围以及分析应用。引用文献56篇。关键词:pH;荧光探针;综述
2、中图分类号:O657文献标识码:A[1,2]化学反应的进行或完成,细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关。在正常的+生理条件下,细胞外液中H的浓度约为40nmol/L(pH=7.40),其变动幅度一般在0.1~0.2个pH单[3]位。酸性和碱性过强会导致心、肺病变或神经类疾病,严重时甚至会有生命危险。因此,pH值的精确测量对化学生物学研究十分重要。测定pH值一般用玻璃电极,但由于存在电化学干扰、可能的机械损伤[1][4]等缺陷而不适于活体pH监测;此外,玻璃电极也不适于极端pH的测量。众所周知,一些有机化合物的荧光或吸光性质随
3、pH的变化可用来指示目标介质中酸碱性的改[5-7][8,9]变。这种基于光学信号变化而建立的pH测定方法,可弥补玻璃电极所存在的上述不足,并得到[10-13]了长足的发展。其中,荧光法测定pH具有灵敏度高、可以采用缓和模式操作(这种技术特别适合研[14,15]究混浊和非均匀体系),分析仪器的几何设计更加灵活等特点。此外,利用各种荧光参数(如荧光强度、荧光寿命等)的变化来测定pH值,不仅便于荧光显微学研究,而且可实时检测细胞内pH的动态分布[16]和区域变化,引起了人们的关注。本文就目前pH荧光探针的种类及应用作一简要的评述。1荧光素及其衍
4、生物荧光素分子的荧光发射波长较长、量子产率高(在0.1mol/LNaOH中,U=0.9)的特性使其成为测定pH的首选荧光探针之一。随着pH的变化,荧光素有着不同的解离形式,其中只有两种阴离子形式的[17]荧光素有较强的荧光发射。当pH接近pKa=6.5时,其吸收光谱出现红移,且两个不同激发波长处的[17]荧光强度的比值与pH的变化呈线性相关,据此,可实现比率法测定近中性范围内的pH变化。不过,荧光素分子易于从细胞内流失的缺陷,使其不适用于一些细胞参数与组分的表征。对此,人们发展了各种荧光素衍生物以克服之。[18]Ohkuma等以异硫氰酸酯
5、荧光素标记右旋糖苷,标记产物的荧光在pH4~7范围内具有敏感响[19]应,籍此测得了巨噬细胞溶酶体内正常的pH值范围为4.7~4.8。Thomas等利用荧光素的甘油二脂+衍生物测定了EhrlichAscites肿瘤细胞内的H浓度变化。荧光素衍生物还常用于制备各种pH传感器[20,21][22]件,Munkholm等将荧光素胺结合在丙烯酰胺-亚甲基二(丙烯酰胺)共聚物上,制得了pH值响应范围为4.0~8.0的荧光传感器。与荧光素相比,2c,7c-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素(BCECF)不易透过细胞膜,且pKa=6.98,更接[2
6、3-31][27]近于中性,故更适于测定各种生理条件下pH的变化。Salvi等利用BCECF荧光光谱随pH变化+的性质,通过测定酯类药物水解生成的H,探讨了酶对酯类药物的催化水解作用。Slavik等藉BCECF在两个激发波长(Kex=490nm和Kex=435nm),或在两个发射波长(Kem=518nm和Kem=529nm)处的收稿日期:2002-12-09通讯联系人:马会民210第2期分析科学学报第21卷[28]荧光强度比值,用比率法测定了单个活细胞内的pH值和膜电位;不同的pH环境可引起细胞质内pH[29]值的变化,从而可考察细胞质在
7、中性范围内的缓冲能力。大脑局部缺血会引起细胞外液酸多症(或称[30]酸毒症),此症状是中枢神经受损的重要体现。Itoh等利用BCECF研究了活体猫脑部局部缺血和再循环过程中,其大脑皮层细胞内pH值随时间的变化,并发现猫脑局部严重缺血时,大脑细胞内pH值降低许多,而且在恢复循环后这种酸性状态至少会持续30min。通过对清醒状态的裸鼠细胞外液中的pH[31]进行无损、连续测定,揭示出裸鼠胞内pH值约为7.5,变化幅度为vpH=0.05。[32]Glaasker等利用异硫氰酸酯荧光素和谷氨酸酯反应,制得了N-(荧光素硫脲基)谷氨酸酯。该探针的p
8、Ka值(6.9)比BCECF的pKa值略低,但用于pH测定时受KCl的影响较小。半萘酚荧光素类(SNAFLs)探针的激发和发射光谱在pKa=7.6~7.9范围内均发生漂移,故可用比[33,34
