荧光光谱分析方法及原理

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1、荧光光谱参考书赵南明，周海梦.生物物理学，高等教育出版社，2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde,W.C.JohnsonandP.S.Hoeds.PrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall,1998某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物萤石(fluospar)而得名。我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸

2、收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。Indiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfate

3、oftheexcitedmolecule.Inmanycasesthesequelisnotveryinteresting;theenergyistransferredasheattothesurroundings.Insomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescence.Wewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptions

4、.荧光光谱的特点BarakandWebbdemonstratedthatasfewas30fluorescentdyemoleculesboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremol

5、eculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicine.Fluorescenceisasensitivetechniquefordetectingbiologicalmaterials荧光光谱灵敏度高的原因荧光辐射的波长比激

6、发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同；荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测；这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，且测量方法简便。荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约

7、10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的10-15秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外可见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。荧光光谱第二个特点是信息量较大基本原理FluorescenceFluorescenceisemissionfromasingletstate,wheretheelectron

8、spinsinthemoleculearepaired.Fluorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbe