色谱柱的选择-博纳艾杰尔科技

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1、液相色谱柱的选择杨定忠博纳艾杰尔科技156119833289；dz_yang@agela.com.cn客服：400-606-80992010年11月12月广东影响C18色谱柱性能的主要因素色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料硅胶纯度粒径比表面积孔径2、色谱柱的构型色谱柱直径色谱柱长度3、固定相键合类型残余硅羟基的影响反相键合相的保留行为键合硅胶的稳定性物理因素化学因素柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘2.7-二羟基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mmBrandZ,C18Column5μ

2、m,4.6mm×150mmVenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流动相：甲醇：水=65：35流速：1mL/min温度：35℃检测波长：230nm进样量：20μL硅胶纯度－金属含量柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II硅胶纯度－金属含量d柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II目前市场主

3、要可供选择的填料粒径1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7μm－多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常规分析颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积每克填料的表面积，与粒度，孔径有关比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I多孔材料的95%以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300Ǻ孔

4、径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大条件：C8色谱柱，4.6×150mm，3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－水中；20min梯度，1030%B；60°C，1.5ml/min色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)

5、-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载样量高固定相对色谱柱性能的影响固定相对色谱柱性能的影响：键合类型A纵向交联：保留和选择不稳定B横向交联：宽pH适用，Durashell，C单体键合：重现性好，柱效高D单体（空间保护）：低pH稳定（VenusilASB）固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的pH值大于4.5-5.0时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法封尾双层表面修饰固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：不

6、能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好TMS固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响双层表面修饰降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响硅胶双层表面修饰后新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2，普通硅羟基pH约为3.5更对称的峰型硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖重现性更好表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖极性化合物保留和分离更好固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响双层

7、表面修饰代表产品：VenusilMPC18，VenusilASBC18，VenusilHILIC0.01ng/mLPseudoephedrineAgelaVenusilASBC18,2.1×50mm,5µmBrandAC182.1×50mm,5µmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5µm固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为同一厂家相同硅胶基质的反相柱：保留值随含碳量的增加而增加比表面积越大，保留值越大键合碳链越长，保留越大C18C8>C3>C1，长链之间差别不大≈固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为不同厂家色谱