崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝

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1、实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱生化与分子生物学研究所实验目的1．掌握生化分离技术——层析技术的基本原理。2．掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。3．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术。1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)

2、层析法依据：混合物中各组分的理化性质差异——吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目的。基本原理：固定相和流动相固定相——固定不动流动相——对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。分类：①流动相的物理状态：气相和液相②方式：纸、薄层、柱③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相凝

3、胶层析(GelChromatography)(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。②基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为SephadexG系列G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150和G-200八种，具体含义为吸水

4、量（g）/10g干胶。交联度与孔径大小成反比：交联度越大（G小），孔径越小，吸水性小；交联度越小（G大），，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。凝胶层析的基本原理样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。数学模型VoViVtVi—凝胶孔内水（内水）Vo—颗粒间水（外水）Vg—凝胶体积总体积Vt=Vi+Vo+VgKd—分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行

5、为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数Ve—洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积Ve=Vo+Kd·Vi洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，01③影响因素层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分

6、子/完全渗透分子。洗脱液：溶解待分离物质，不变性加样量：1%～5%凝胶的再生实验原理本实验以葡聚糖凝胶G-25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖-2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为669，二者分子量相差较大。两者混合物加到葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱的时间不同而分开。实验方法1.凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，把杂质漂洗干净。2.装柱：⑴将层析柱垂直夹于铁架上

7、，先加入蒸馏水10ml，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约2-3cm时关闭出口，以排除底部气泡。⑵将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，灌注高度为10-12cm。⑶用螺旋夹控制流速为20-40滴/分钟，用洗脱缓冲液平衡几分钟后，即可使用。3.加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺旋夹拧紧。取样品200μl沿层析柱内壁缓缓加入到液面上，打开螺旋夹，用烧杯收集流出的液体。当样品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。4.收集：先用量筒收集洗脱液体（约4ml），待柱中蓝葡聚糖-2000开始移出改用EP管收集液

8、体，每管收