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1、三维细胞培养技术的简介闫辉2014.10.9目录1三维细胞培养技术的概念2三维细胞培养技术产生的背景3三维细胞培养技术的亮点4三维细胞培养模型的建立5三维细胞培养技术的应用6三维细胞培养技术的发展前景1三维细胞培养技术的概念三维细胞培养技术(three-dimensionalcellculture,TDCC)是指将具有三维结构不同的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质（extracellularmatrixc，ＥＣＭ)（1）蛋白充当生长支架,使
2、得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。2三维细胞培养技术产生的背景细胞的体外培养,关注的不仅仅是它们的分裂生长,而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下,单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合,因为细胞在体外改变的环境下增生,逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化,难以研究单一过程。另外,我们在动物身上所观察到的结果,往往是最终呈现的表现,而非研究者最为关心的中间过程。显然,如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟,一直是生命
3、科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域,迫切需要建立一套细胞培养技术,既能生长传代,还能最大程度地维持体内性状,并分化产生新的组织结构,以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展,三维细胞培养技术就应运而生了。3三维细胞培养技术的亮点①三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接和/或缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构； ②三维培养细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与单层培养均有明显差异，而与体内细胞生长情况更为相似；因此，三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性
4、及条件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。4三维细胞培养模型的建立4.1三维基质胶（2）的种类以及常用基质胶的介绍4.2三维模型的种类4.3常见三维细胞培养模型的建立方法4.1.1目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于悬浮细胞的培养，还有一种是血纤维蛋白，将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。4.1.2实验室大量使用的基质胶是Matrigel胶，是从小鼠肿瘤组织中提取的
5、抽提物，在室温下，Matrigel可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。Matrigel基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。4.2三维细胞培养模型的种类三维立体培养的方法有多种，常用的有胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)和三明治培养模式(细胞生长
6、于两层胶原中间)。4.2常见三维细胞培养模型的建立方法4.2.1胶内培养模式的建立方法Matrigel母液浓度10.6mg/mL（3）,放置于4℃溶解(4)。消化细胞,重悬至完全培养基中计数,细胞悬液浓度为1×106/mL。使用时置于冰上,用预冷的细胞重悬液与Matrigel等体积混匀,24孔板中每孔加入100μl。37℃放置30min使其成胶,添加完全培养液。置于37℃5%CO2细胞培养箱中孵育,第二日换液,此后每隔一日换液一次[1]。4.2.2胶上培养模式的建立方法在24孔培养板中每孔加入75µl冰上过夜解冻的Matrigel，置于37℃孵箱中孵育15min以上使Matr
7、igel聚集。同时胰酶消化常规培养的正常鼻咽细胞及其高转移潜能亚株5-8F,计数后离心收集细胞.然后把细胞悬浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培养液中，细胞浓度为2*104/ml用加样枪吹打成单个细胞后,每孔加入400µl细胞悬液于已经凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培养，每3-4天换新鲜培养液[2]。4.2.3三明治培养模型的建立方法三明治模式前期工作和凝胶上模式相同,不同之处在于凝胶上的细胞经培养融合至(70、80)%左右时,吸去培养液,用无菌PBS
