细胞死亡判定--讲课用第四节

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1、细胞死亡判定中南大学生物科学与技术学院李杰jlee@mail.csu.edu.cn提纲细胞死亡判定意义细胞死亡定义及判定方法细胞死亡判定方法中存在的问题细胞死亡判定方法使用—兼谈人体死亡判定一细胞死亡判定意义种子筛选发酵抗癌药物筛选二细胞死亡定义及判定方法细胞死亡的定义细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡呼吸-代谢-繁殖平板计数法1.繁殖力克隆形成实验clonogenicassayMPNmostprobablenumber屏障作用膜不对称性破坏2细胞膜2.1细胞膜完整性显微镜观察？电子显微镜

2、？染料类别膜通透性染料非膜通透性染料常见膜完整性检测用染料传统可见染料：甲基蓝、Evan’sBlue、NeutralRed传统可见染料的不足荧光染料：PI、SYTOX、SYBREB&FDA流式细胞仪应用流式细胞仪的优点准确快速：一般分选速度＞1000个/秒大量多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）Lymphocytes:淋巴细胞Monocytes：单核细胞Granulocytes：粒细胞PI&AnnexinV-FITC分析细胞凋亡问：凋亡细胞是活细胞还是死细胞？2.2细胞膜电位测定细胞膜电位染料正电荷：Rhodamine123、Car

3、bocyanines，DiOC6(3)，DiOC2(3)，DiSC3(5)负电荷：DiBAC(3)3.能量相关3.1ATPATP测定方法ATPADP荧光素加氧荧光素荧光素酶活细胞比率处理组含量对照组含量=100%ATP法特点敏感性高：可检测最少20个细胞适用范围较广：可对实体瘤、胸腹水、血液等多种肿瘤标本进行体外药敏检测时间短：30-60分钟内Tetrazolium家族四氮唑化合物3.2氧化还原脱氢酶MTS还原产物具溶解性3.3pH梯度检测染料carboxyfluorescein(cF),BCECF,pyraninecSNARF-1pHand

4、Health荧光素二乙酯（FluoresceinDiacetate，FDA）4.酯酶5.分子生物学技术DNA等分子在死亡细胞中比活细胞中更快降解长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力检测对象DNArRNAmRNA检测方法：DNAprobe检测方法：PCRPCR扩增方法RT-PCRNASBA(nucleicacidsequence-basedamplification,依赖性核酸序列的扩增)RT-SDA(reversetranscriptase-stranddisplacementAmplification,链替代扩增)细胞死亡判定方法总结Ke

5、er&Birch,2003三细胞死亡判定方法中存在的问题现有方法存在的相关问题1膜完整性测试：染上颜色的细胞一定是死亡细胞？MTT,FDA：没有染上颜色的细胞一定是死细胞？膜完整性测试活性染料阴性细胞能否再存活？Caronetal.,1998问题2：活性染料越深生命力越强？Resveratrol白藜芦醇蒽醌萜类化合物蓼科植物虎杖白藜芦醇的功效天然的抗氧化剂葡萄酒中的抗癌明星法兰西奇迹具有神奇抗癌效能的白藜芦醇白藜芦醇的抗白血病作用白藜芦醇处理细胞MTT还原活性白藜芦醇处理细胞MTT还原活性生长抑制细胞MTT还原活性上升原因探讨Breeuwere

6、tal.,1994.AEM.60(5)1467-1472Jochem,1999.MarineBiology.135:721-728酯酶活性的存在2.完整的细胞膜问题3：FDA染色中存在的问题0C0C30C■DES▲DCCD●noneEnergy-dependent,Carrier-Mediatedextrusion▲TPP●none缓冲液等对荧光强度的影响培养基组成对荧光强度的影响荧光影响因子四细胞死亡判定方法使用—兼谈人体死亡判定以后的科研工作中该如何使用？心肺死亡概念脑死亡判定全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑

7、功能不可逆终止脑干死亡：为意识和认知功能的丧失是脑干上行网状结构受到破坏，必将导致患者全脑功能的丧失而死亡。高级脑死亡：把意识功能的丧失作为诊断的关键脑死亡男子器官即将移植时苏醒Fourmonthsafterhewasdeclaredbraindeadanddoctorswereabouttoremovehisorgansfortransplant,ZachDunlapisontheroadtorecovery离奇！脑死亡与器官移植患者获得器官移植尿毒症150万0.5万白血病400万3万肝移植100万1万谢谢！谢谢EXIT