第七章 高等动物基因1 哺乳动物表达系统

《第七章 高等动物基因1 哺乳动物表达系统》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程GeneticEngineering陈武cwy_100@163.com生命科学与生物制药学院２００8基因治疗转基因动物与动物反应器哺乳动物表达系统高等动物基因工程的基本概念第七章高等动物基因工程第一节高等动物基因工程的基本概念高等动物基因工程哺乳动物细胞表达系统高等动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物品种改良疾病模型用于药物筛选研究基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型D哺乳动物表达系统的基因转移方法第二节哺乳动物表达系统C哺乳动物表达系统的载体系统B哺乳动物表达系统的受体系统A哺乳动物表达系统的优缺点E提高哺乳动物细胞表达重组蛋白的方法及应用优点：表达的蛋白与

2、天然蛋白在结构、糖基化、磷酸化、寡聚体类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白。如EPO（促红细胞生成素）缺点：哺乳动物细胞的表达水平低；获得高表达细胞株所需的时间长；细胞大规模培养的成本高；哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高；（一）哺乳动物细胞表达系统优缺点：哺乳动物细胞表达系统的构成受体系统载体系统转基因技术（1）正常的哺乳类动物细胞具有四大生物学特征:（二）　哺乳动物宿主系统锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞扁平状，并有长纤维网状结构（2）高效表达外源基因受

3、体细胞应具备下列条件：细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养合适的标记便于转化株的筛选和维持遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存生长快且齐分裂周期短，生长均一，便于控制安全性能好不合成分泌致病物质，不致癌(3)常用的高等哺乳动物受体细胞1.迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要是中国仓鼠卵巢细胞（CHO）其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）2.1981年，Gluz

4、man用编码野生型T抗原但复制起点缺失的SV40，转化允许SV40裂解性生长的非洲绿猴肾细胞CV-1，获得了三个细胞系：COS1、COS3、COS7。这三个细胞系均含有T抗原，保留完全的允许SV40裂解性生长的能力（被广泛地用于瞬时表达系统）。T抗原作用：当表达产生的T抗原结合到SV40的复制点的DNA调控区，病毒DNA的复制即被启动。思考：COS细胞作宿主细胞表达的优势？3.BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来成果：用它表达的重组凝血因子VIII已获准投放市场。4.C127细胞：来自RIII小鼠乳腺肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染：用C127细胞生产的重组

5、人生长激素（hGH）已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症。5.MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得的，是贴壁生长的上皮样细胞：有报道用该细胞结合人巨细胞病毒早早期启动子可高效表达分泌蛋白，表达量占细胞分泌蛋白质总量的15%～20%。(4)高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP次黄嘌呤（H）GMPAMP）尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）氨基喋呤（

6、AP）氨基喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径氨基喋呤（AP）二氢叶酸还原酶（DHR）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的（tk-）受体细胞不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的不能在含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补（hprt-）受体细胞高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标

7、记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR-二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A（三）哺乳动物细胞载体系统(1)哺乳动物细胞