pcr常见问题、原因分析及其对策

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1、PCR常见问题、原因分析及其对策主讲人：欧阳志荃PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略主讲内容PCR技术简介PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则引物扩增产物太少反应体系对PCR扩增的影响反应BufferpH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂Mg2＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTP

2、Mixture浓度适当避免反复冻融ddH2OpH值适当避免污染PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液Mg2＋dNTPddH2O耐热聚合酶如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR实验的不同需求如何选择最合适的DNA聚合酶－－DNA聚合酶的特性纯度稳定性酶活性如何选择最合适的DNA聚合酶－－PCR实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒扩增效率保真性特异性基因组扩增、RT-PCR基因筛选、测序、基因克隆复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学复杂模板扩增、大规模基因检测特异性－热启动Taq酶原理蜡封抗体抑制化学修饰特点避免非特异性扩增提高PCR反应的特异性

3、用途基因组扩增RT-PCR－热启动Taq酶特异性产品类型产品名称产品性能化学修饰天为时代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:Thermo-start®DNAPolymeraseStratagene:SureStart™Taq大大提高PCR反应的特异性化学修饰不影响后续实验抗体抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum®TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蜡封Promega：TaqBeadTMHotStart保真性—高保真酶原理用途3’－5’核酸表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SN

4、P）外切酶活性降低碱基错配率保真性—高保真酶产品类型生物公司性能比较PfuDNAPolymerase天为时代StratagenePromega在目前已发现的所有耐热聚合酶中,Pfu保真度最高碱基错配率最低PyrobestTMDNAPolymeraseTaKaRaTliDNAPolymerasePromega高保真＋高扩增效率原理混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用途超长片段扩增－测序－构建基因图谱复杂模板扩增－GC含量高－二级结构高保真＋高扩增效率特点产品性能高扩增效率天为时代：TaqPlusTaKaRa：ExTaqTM复杂模板扩增高保真天为时代：TaqPlatinumInvitrog

5、en：PfxPlatinumTaqHighFidelity保真度低于Pfu聚合酶但扩增效率较高长片段扩增天为时代：LongTaqTaKaRa：LATaqInvitrogen：ElongaseAmplificaitonSystem特别适用于保真度较高的超长片段扩增PCRMasterMix原理预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂PCRMasterMix特点快速简便减少加样误差和污染灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性稳定性好长期放置活性无改变适用范围大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本GC含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本

6、可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题之二非特异性扩增现象：PCR扩增

7、后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数非特异性扩增PCR常见问题之三拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12PCR常见问题之三模板不纯Buffe