发酵工程第十三章发酵产物分离原理与技术

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1、第十三章发酵产物分离原理与技术发酵产物分离原理与技术第一节沉淀分离法第二节吸附和树脂分离法第三节离子交换法和离子交换膜电渗析分离法第四节萃取与浸取分离法第五节膜分离技术第一节沉淀分离法沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。沉淀法方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段。沉淀法的分类：等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法生成盐复合物沉淀法热变性及酸碱变性沉淀法一、等电点沉淀法原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低；优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸的价

2、格低廉，并能为食品标准允许；缺点：酸化时易引起蛋白失活。不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛素的等电点为5.3，在与Zn2+结合形成胰岛素锌盐，其等电点升为6.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要注意调整pH。等电点沉淀法的实例从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。碱性磷酸酯酶的pI沉淀提

3、取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。等电点沉淀法等电点沉淀法的适用范围：明确pI的两性物质；疏水性较大的蛋白质。二、盐析法蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。盐析法的原理盐析法的影响因素1、盐析法的原理原理：①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的

4、水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。盐析原理示意图盐析原理图1碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用Cohn方程式表示：logS/S0=－Ks·IlogS=β-KsIS—离子强度为I时的蛋白溶解度(g/L);S0—纯溶剂（即I=0）时蛋白的溶解度；Ks—盐析常数，与温度和pH无关；I—离子强度当温度一定时，S0对于某一溶质是一常数，即logS0=是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大

5、小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种类无关。盐析法原理盐析法分离蛋白质时，可分两类：1）在一定的pH值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法——“K”分级盐析法2）在一定离子强度下，改变溶液的pH值及温度的沉淀方法——“”分级盐析法2、盐析的主要影响因素盐溶(saltingin)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较

6、强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对Ks值的影响，Ks值越大，该盐的盐析效果越好。1）蛋白质浓度高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻2）离子强度和种类3）温度温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。4）pH值除与蛋白质和温度有关

7、外，还与pH有关；盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pH几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离子的强度不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)（NH4)2SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠温度和pH值的影响温度对碳氧血红蛋白盐析曲线的影响pH值对β的影响三、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法的原理有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀

8、法的优缺点有机溶剂沉淀法的注意事项有机溶剂沉淀法举例1、有机溶剂沉淀法的原理许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降低水溶液