组织培养技术-2012

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1、组织培养TissueCulture一、组织培养的定义组织培养：细胞、组织或器官→离体→合适的培养液、温度、无菌→使之生存和生长根据培养物的不同，组织培养又可分：细胞培养、组织培养和器官培养。二、组织培养的应用1.优点：（1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。（2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。（3）可研究各种理化因素（温度、药物、毒素等）对细胞代谢、增殖、分化的影响。（4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。应用：病毒学：细胞培养是分离培养病

2、毒的重要手段，用于病毒感染的诊断，生产病毒疫苗。免疫学：杂交瘤-单克隆抗体技术。遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析，进行遗传学诊断，试管婴儿等。肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。2.不足之处：体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的差异，故对结果的判断应慎重。二、组织培养的应用三、培养细胞的特性1.培养细胞的分型（按生长方式分）（1）贴附型：（2）悬浮型：1.培养细胞的分型（按生长方式分）（1）贴附型：大部分细胞附着于支持物表面生长，分化不明显，形态单一，常反映其胚层起源。如上皮细胞型

3、，成纤维细胞型，多形细胞型。上皮细胞型成纤维细胞型（2）悬浮型：不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排列；见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。悬浮型细胞三、培养细胞的特性2.培养细胞的生长和增殖原代培养（PrimaryCulture）：从体内取出组织开始在体外培养，在其传代之前。传代培养（Subculture）:将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液。细胞系（Cellline）：原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。细胞系的生长过程有限细胞系无限细胞系二倍体细胞大多可传30-5

4、0代，相当于150-300个细胞周期，维待一年左右的生存时间。细胞系的生长过程原代培养期：1-4周，与体内细胞相似，但分裂不旺盛，含细胞类型较多。传代期：持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保留原组织细胞的很多特征，一般传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢。衰退期：细胞增殖缓慢，并逐渐停止，细胞形态轮廓增强，最后衰退、死亡。实验研究的最佳时期：传代期（10代以内）三、培养细胞的特性1.营养需要：碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素2.生存环境：温度：PH值：气相：渗透压：3.无污染及无毒：35℃-37℃耐

5、低温不耐高温7.2-7.4宁酸勿碱O2、CO2（5%）NaHCO3-CO2260-320mmol/L3.培养细胞的生长条件防止污染要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等）的污染、不同细胞类型的交叉污染。出现以下情况时培养细胞可能有污染：1)培养液的酸碱度异常改变，如短期内颜色变黄；2)培养液出现混浊；3)光镜观察到大量颗粒或菌丝；4)细胞生长停止或出现死亡。四、组织培养的常用设备1.仪器包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备，如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微

6、镜、离心机、液氮容器等。超净工作台CO2培养箱四、组织培养的常用设备2.器皿培养瓶培养皿培养板四、组织培养的常用设备3.试剂（1）天然培养基：动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。（2）合成培养基：如RPMI1640、DMEM、199等。多采用合成培养基+天然培养基（5-20%）。（3）平衡盐溶液：由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配液、维持渗透压，调节PH值等，如PBS、Hank’s等。（4）消化液：用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。五、基本培养技术1.无菌操作2.取材3.组织分离4.

7、原代培养5.传代培养6.细胞冻存与复苏五、基本培养技术1.无菌操作：防止污染是决定组织培养成败的关键，必须无菌操作！（1）培养前的消毒灭菌待用物品：洗涤、消毒灭菌。无菌室：紫外线照射30-50min，新洁尔灭拖地。超净台：75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射30min。（2）洗手和着装彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。（3）无菌培养操作超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能

8、混用。转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。饭盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面。面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。操作完毕，整理台面，酒精擦拭。五、基本培养技术2.取材：新鲜、无菌、避免有害因素损伤。五、基本培养技术3.组织分离（1）离心分离：用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液，5