细胞培养环境、设备、耗材与试剂

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1、细胞培养环境、设备、耗材与试剂1.环境：细胞培养需要创造一个尽量无菌的环境，所以基本要求是一间密闭的带有空气净化系统的实验室。实验室要安装能够进行表面杀菌的紫外灯，一般装置在室内顶部，与日光灯分开控制。2.设备：一般的细胞培养需要二氧化碳细胞培养箱，达到细胞实验操作要求的超净台，倒置显微镜，液氮罐，冰箱，水浴锅，离心机，微量移液器等。3.耗材：基本的细胞实验耗材包括酒精灯、脱脂棉花、封口胶、细胞培养瓶、细胞培养皿、移液管、50ml离心管等。耗材可以购买细胞培养专用的一次性耗材，也可使用长久性的玻璃器皿。但是如果是使用长久性的玻

2、璃器皿，必须将其用牛皮纸包裹好，然后经过湿热高压灭菌和灭菌后烘干。牛皮纸在放进超净台时才能拆除。4.试剂：根据培养的细胞种类的不同，需要的试剂也不同。基本要求包括培养的细胞对应的培养液，胎牛血清，L谷氨酸，双抗（青霉素和链霉素），0.25%胰酶以及PBS。1.试剂可以通过生物公司订购，其中双抗、胰酶和PBS也可以自行购买原料配制。1、配制双抗时要用灭过菌的双蒸水，用一次性无菌注射器进行配制，整个配制过程要在超净台内操作。2.配制胰酶时要使用灭菌后的双蒸水，配制好可以用带0.22微米微孔滤膜的过滤器进行过滤灭菌，整个过滤灭菌过程

3、要在超净台内操作。3.配制PBS可以使用不灭菌的双蒸水，配制完成后再经过湿热灭菌。5.部分试剂的配方1.100×L谷氨酸：L谷氨酰胺0.2M2.10×PBS：1000ml中含NaCl8.5g，Na2HPO4.12H2O30.8g，NaH2PO4.2H2O2.8g3.100×双抗：青霉素10000U/ml，链霉素10000ug/ml4.胰酶：0.25%胰酶，0.03EDTA6.细胞完全培养液的配置细胞完全培养液，以293细胞为例，需要含10%胎牛血清、2mmol/L的L谷氨酸的DMEM培养液。配置好的DMEM培养液，根据实验要求

4、的不同，选择是否加入双抗。双抗终浓度为100单位/ml。细胞培养实验基本操作要求1.每天应该对细胞实验室进行半小时的紫外照射灭菌。紫外辐射对人体有害，灭菌时，人员不能进入细胞实验室。2.进入细胞实验室操作的人员，应该身着消毒过的白大褂，更换消毒过的拖鞋，操作有毒试剂要带好手套。外来带入的物品，都要经过紫外照射或者酒精擦拭的表面灭菌。3.裸手进行细胞操作，则要在操作之前用消毒液洗手，并在将手伸进超净台前用酒精擦拭全部手部皮肤。带橡胶手套进行细胞操作，在将手伸进超净台前也要用酒精擦拭手套的整个外表面。4.试剂要按储存要求保存，在超

5、净台内打开过一次的试剂，储存前要用封口膜封住瓶口，并最好在封口膜上表明打开日期。5.使用超净台之前，应该将超净台的机玻璃板合上，打开超净台紫外开关进行半小时的紫外杀菌。超净台紫外灭菌完毕后，应关闭紫外开关，打开超净台通风开关，然后才能打开有机玻璃板。一般在使用超净台时，有机玻璃不能离台面太远，保持在20cm以内。6.超净台灭菌以后，任何拿进超净台的物品都要用酒精擦拭物体的全部表面，然后在酒精未干之前放进超净台。要使用到的细胞培养耗材可以在超净台灭菌前放入其中，跟超净台一起灭菌。而细胞培养要使用到的试剂则不可以放入超净台接受紫外

6、照射。7.细胞实验要使用到的直接接触细胞的试剂，一般要在37度水浴锅中预热半小时，使其温度接近37度。8.细胞离开培养箱被进行操作的过程不宜过长，否则由于外界温度和二氧化碳浓度的不适，会导致细胞状态不好甚至死亡。9.细胞培养用的器皿，包括培养瓶、培养皿等等，要对着酒精灯的火焰打开开口，操作过程开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。细胞培养使用的试剂，在酒精擦拭试剂储存器皿后带入超净台。打开瓶盖之前要再用酒精棉花擦拭瓶口，然后对准酒精灯火焰打开开口。操作过程整个开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。10.操作过程最重要的原则是保

7、持细胞和试剂无菌，并且避免细胞和试剂之间、试剂和试剂之间的交叉污染。比如已经将移液管伸入细胞瓶里吹打细胞，那么要再吸取新的培养液加到培养瓶中则不能再使用该移液管，一定要更换新移液管再去吸取新的培养液。尽量减少细胞和培养液暴露的时间。细胞的传代和培养（以293细胞为例)1.传代：一般贴壁细胞长满培养瓶培养面积的90%左右就应该对细胞进行传代。贴壁细胞长满培养面，就会产生接触抑制，影响细胞的状态。1.对着酒精灯火焰打开细胞培养瓶，用移液管小心吸去培养液，注意移液管不要碰到细胞层，吸液时可将细胞瓶稍微倾斜。2.吸取2-3mlPBS漂

8、洗细胞，去掉残余血清并平衡盐离子。具体操作为：将PBS从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让PBS溶液覆盖整个细胞表面，之后再把PBS溶液吸去。移液管注意不能碰到细胞层。3.吸取1-1.5ml25%胰酶加入培养瓶，将细胞从培养平面上消化下来。具体操作为：将胰酶从背对着细胞层