《固定化酶》ppt课件

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1、固定化酶深圳大学吴海强一、概述生物催化剂作用方式示意固定化酶的发展史什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体酶自身载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术化学偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶固定化酶的优缺点可重复使用可以装塔连续反应优点：纯化简单，易与产物分离提高产物质量应用范围广固定化过程中酶易失活缺点：首次投入成本高大分子底物较困难二、固定化酶的性质及其影响因素（一）固定化酶的性质（二）固定化酶性质改变的原因（三）评价固定化酶的指标（四）固定化酶的活力测定方法（一）固定化酶的性质1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速

2、度下降。原因：酶结构的变化空间位阻2．固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高；（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高；（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低；（4）对分解酶的稳定性提高；（5）对变性剂的耐受力升高。固定化酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.抑制自降解，提高了酶稳定性。c.酶活力的释放是缓慢的。3．最适pH的变化pH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。载体对固定化酶体系pH的影响载体带负电荷

3、，pH向碱性方向移动。微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。产物性质对固定化酶体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5．底物特异性变化作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。6．米氏常数Km的变化Km值随载体性质的变化而变化载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降低了酶的亲和力，Km’>Km。载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶

4、增加了酶的亲和力，Km‘

5、（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力（四）固定化酶的活力测定方法1.振荡测定法：2.酶柱测定法：3.连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。三、酶固定化技术微型胶囊法吸附法胶格包埋法共价交联法共价偶联法1、微

6、型胶囊法是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。微型胶囊法制备固定化酶有两种方法①界面沉淀法这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。②界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。2、吸附法I物理吸附法静止法电沉积法反应器上直接吸附法混合浴或振荡浴吸附法优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等

7、。II离子结合法酶分子与含有离子交换基团的固相载体相结合第一个离子结合法固定化酶：DEAE—Cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶3、胶格包埋法首先被采用的胶格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂－－inactiation将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。4、共价交联法5、共价偶联法可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚

8、基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体上引进活泼基