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1、单个活态细胞的显微激光共焦拉曼光谱扫描技术应用研究——光学工程郑晨6121201006目录1、关于单个活态细胞的激光共焦拉曼光谱扫描技术的简介2、显微共焦拉曼散射扫描技术3、显微激光共焦拉曼散射光谱仪扫描参数优化和谱线处理技术研究4、红细胞拉曼光谱研究5、总结与展望1、关于单个活态细胞的激光共焦拉曼光谱扫描技术的简介1、生命科学是当今发展最为迅猛的一个领域,世界各国都在利用各种可能的手段和技术探索生命的奥秘。激光共焦拉曼散射光谱技术正是进行生物医学工程方面研究的有力工具之一。2、拉曼光谱在70-80年代得到了高速发展,在生物、医学领域也进行了众多研究
2、和应用。但是由于其信号较弱等缺点,对于非共振类型的样品,则存在应用局限。3、1990年Pupples等人针对原有拉曼散射截面小等缺点,为了提高拉曼信号强度发展出高灵敏度共焦拉曼光谱仪,使之对不具有共振特点的样品的拉曼光谱也具有很好的探测能力。Wood获得的随时间变化的红细胞拉曼图像和拉曼光谱。2、显微共焦拉曼散射扫描技术2.1拉曼散射概念当电矢量为E的单色光入射到样品,样品的分子或原子的正负电荷分布发生变化形成电偶极距。该电偶极子的振动可辐射电磁波,发出散射光。入射光与被照样品分子的作用不但可产生频率不变，强度很强的弹性散射一瑞利散射;还会产生频率发
3、生变化的非弹性散射一拉曼散射。拉曼散射有stokes散射和反stokes散射。拉曼散射是光子与分子碰撞过程中,分子的振动和转动能量传递给光子,从而使光子的频率发生变化所产生的。a图：分子光散射的几种成分：入射光（左下角）作用于分子产生了瑞利散射光（右上角）和拉曼散射光（右下角）b图：拉曼散射跃迁示意图2.2拉曼散射测量参数1、拉曼散射的频率,或拉曼位移。拉曼位移的常用单位为波数。实际应用中常用其Stokes散射谱。拉曼位移只与振动与转动能级有关,拉曼位移可反映物质本身内在的分子结构的信息。2、强度I,即样品拉曼散射信号强度，处于共振态的谱带会显著增强
4、。拉曼散射信号强度与入射光频率和极化率张量的变化有关。3、去偏振度，也称为退偏比,它可表示散射物体各向异性的程度。因此,进行拉曼光谱测量时通过测定样品的拉曼散射波谱和强度,可以获得样品分子伸缩振动和弯曲振动模式的信息,从而实现对被测样品的分子结构以及含量作出判断。2.3拉曼散射的优缺点1、优点：（1）、拉曼光谱测定无须借助任何标记物（2）、拉曼散射光谱技术可对溶液、气体、固体、薄膜、晶体等各种形式的物体进行实验（3）、拉曼光谱可在很短的时间内快速获得(小于1s)（4）、拉曼光谱技术单次扫描的覆盖波数范围比红外吸收技术的覆盖区域大2、缺点：（1）、最主
5、要的缺点是拉曼散射信号较弱,故对样品的浓度要求高。（2）、在采用波长较短激光做激发光时,容易引发样品荧光,从而常使拉曼光谱受到荧光的干扰,在使用中须尽量避免或滤除荧光的干扰2.4、共焦技术的引入上世纪90年代Pepple提出了共焦技术。共焦技术使得只有焦平面的信号可通过信号通道进入接收系统,而焦平面上或下的信号则被共焦孔阻挡,样品照明光阑针孔和光电检测光阑针孔互为共扼形成了共聚焦显微光路。共焦显微镜利用共焦技术可对更精细位置的物质进行探测,可以进行单细胞水平的细胞内不同区域的探测利用共焦技术可对样品内特定的小区域进行扫描,可利用共焦技术可实现点扫描!
6、线扫描!二维扫描和三维扫描"2.4.1共聚焦扫描显微镜的原理2.4.2二维扫描技术（拉曼成像）二维扫描拉曼光谱技术是利用亮场像选取要成像的二维区域,并设置两个方向的扫描范围及相邻两个扫描点的间隔，得到各个点的拉曼光谱后,再根据感兴趣的谱线或谱型特点,对特定分子的二维分布成像。也可以同时对几种感兴趣分子或分子结构在二维空间的分布成像。如果配备了二维CCD探测系统和相应的位置控制系统,可以进行快速的二维扫描逐点扫描的二维拉曼光谱扫描技术3、显微激光共焦拉曼散射光谱仪扫描参数优化和谱线处理技术研究进行拉曼光谱测量时通过测定样品的拉曼散射谱频移和强度,可以获
7、得样品分子伸缩振动弯曲振动模式的信息,从而实现对被测样品的分子结构以及含量作出判断扫描参数优化的意义是以较短的时间、较少的样品、近乎无扰的状态获得高品质的拉曼谱线。而针对不同的细胞样品与不同的实验目标需设立对应合适的扫描测定以及光谱处理分析技术3.1方法对活态细胞产生影响的主要因素是激光功率密度的大小、激光照射时间的长短等，因此在进行参数优化前,一些参数可以提前进行预设对于点扫描模式,在物镜、共焦孔径等参数确定下来后,主要的变量参数为照射到样品的激光功率密度对于线扫描和二维扫描模式,除了激光功率密度外,还要考虑扫描的步进距离(扫描点间隔)或其他因素线
8、扫描模式下,红细胞在不同样品照射激光功率和扫描步进设置下扫描前(左)后(右)亮场像比较4.红细胞拉曼光谱研究
