NC膜吸附蛋白的常见问题处理

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1、NC膜吸附蛋白的常见问题处理基于膜的检测试剂研发人员应该严格考虑影响蛋白质在硝酸纤维素膜上结合众多因素，其中包括原材料的固有属性和处理过程等。随着胶体金标记技术的发展、研发人员对胶体金快速检测技术深入研究，市场上基于膜的快速免疫层析检测产品的种类迅速增多。虽然免疫层析产品的包装设计种类繁多，实际上目前主流的商品化检测试剂盒主要下面两种形式。最常用的检测形式为侧向层析或者层析定量，这种检测形式通常应用于诊所或者由直销客户检测。另一种检测形式为竖向斑点渗滤，该检测形式需要较强的操作技巧，仅限于研究使用。不管试剂采用那种

2、检测形式，灵敏、可重复的检测试剂的生产需要试剂生产商采用有效的途径制备检测线工作液。快速诊断试剂生产商经常对如何优化检测线相关的文章非常感兴趣。这些文章可以有助于研发人员涉及关于蛋白质固着于硝酸纤维素膜基本原理的讨论，并对研发人员在开发免疫层析试剂中面临的常见问题给予强调。由于关于蛋白质吸附于NC膜的问题普遍存在于侧向层析，因此这篇文章重点讨论这方面的问题。蛋白质吸附的重要性图1依靠在膜上适当的结合捕获试剂，用试纸条检测样本可以获得清晰、明显的结果。在免疫层析检测中，蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂。由于检

3、测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对检测结果非常重要（见图1）。自从NC膜第一次应用于蛋白质吸附以来，已有相当多的关于蛋白质吸附于NC膜的研究，但蛋白质吸附于NC膜的确切作用机理仍然不能确定。虽然多种作用力在结合中起到作用，尤其比如疏水力、氢键、静电作用，但是每种作用力的重要性和明确的效果仍然让人难以琢磨。目前有两种比较合理的作用模式。第一种模式认为，蛋白质最初通过静电作用被吸附到NC膜表面，而长期的结合作用是通过氢键和疏水作用完成的。虽然这一原理难以证明，但与已发表

4、的文献实验结论一致，也是最为接受的作用机理。图2本检测结果中的捕获线有代表性的反应了蛋白吸附问题表2在这几个例子中，样品检测结果的检测线存在明显的蛋白质结合问题。第二种模式认为，蛋白质首先通过疏水相互作用结合到NC膜上，通过静电力牢固地与NC膜结合则。该结合模式同大量已发表的文献结果一致，然而静电作用机理对于采用干燥或乙醇吸附方法到达的蛋白质长期稳定的吸附于NC膜上无法提高合理的解释。不管蛋白质结合的作用力如何达到平衡，研究人员在优化蛋白质吸附于特定的NC膜时，必须综合考虑所有影响蛋白质吸附的作用力。这一观点不可避

5、免的影响着试纸条板材的选择及其处理工艺。例如，如果产品开发人员选用可以极度降低静电相互作用或者疏水相互作用的缓冲液，那么蛋白质的吸附能力则剧烈的降低。同理，蛋白质点膜后充足地干燥对于确保蛋白质长期稳定地固着于NC膜非常重要。生产商选用的材料能够有效地将蛋白吸附于NC膜上。影响蛋白质吸附于NC膜的材料通常有3种类型：非特异性的蛋白质、影响静电相互作用以及疏水相互作用的物质。常见的能够降低蛋白质结合的物质包括竞争蛋白质结合位点的其他蛋白，如BSA、动物血清，干扰氢键的形成物质（如甲酰胺、尿素），影响疏水作用形成的物质（

6、如Tween、Triton、Brij）。人工合成的结合物比如聚乙烯醇、聚乙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮也可以影响蛋白质的结合，它们的作用机理可能是抑制一个或者多个蛋白质与NC膜结合的共同作用的结果。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显（见图2）。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低（见图3）。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。

7、在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。图3弱的捕获线反应了吸附于膜上的蛋白量很低图4流过的待检蛋白和表面活性剂溶液洗掉NC膜吸附的捕获蛋白导致检测结果出现扩散的检测线。体外诊断试剂研发人员经常遇到上述问题，而且这些问题明显地延长了免疫层析检测试剂的研发周期。为了了解如何解决上述问题，研究人员首先应该牢固的掌握影响蛋白与NC膜结合的各种因素，包括材料的固有属性及其检测前的处理过程。本文的第

8、一部分就这些问题进行讨论，第二部分主要介绍在技术上如何解决这些问题（待发表于IVD技术杂志）。影响蛋白质吸附的因素当研究蛋白质捕获剂结合于NC膜时，研发人员应该考虑下面五个影响蛋白质结合作用机理的每一个关键因素。Ø溶解捕获蛋白的工作缓冲液；Ø用来固着捕获蛋白的NC膜；Ø捕获蛋白自身；Ø将捕获蛋白点样于NC膜的系统；Ø捕获蛋白点样时的环境湿度。虽然很多研发实验