《实验四圆盘电泳》ppt课件

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1、实验四圆盘电泳分离人血浆蛋白质紫外吸收法测定蛋白质的含量一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）玻璃管分离胶浓缩胶(-)(+)◇主要过程◇凝胶柱的制备加样电泳剥胶固定和染色漂洗(-)(+)1．凝胶玻璃管的准备（封口）2．分离胶的制备3．浓缩胶的制备4.玻璃管安装凝胶柱的制备与安装封口胶封口防漏配液防凝操作防毒滴管灌胶6%分离胶的制备（每组四人）A液1mlC液2mlH液2mlG液5ml正丁醇封顶等待聚合（约30分钟）混匀后分装4管3%浓缩胶的制备（每组四人）B液1mlD液2mlE液1mlF液4ml正丁醇等待封顶聚合（约10分钟）混匀后分装4管注意事项：丙烯酰胺

2、和甲叉双丙烯酰胺（C、D）是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。用完加盖。TEMED（A、B）要密封保存，用完加盖。过硫酸铵（G）溶液最好新鲜配制，以防止氧化失效。用完加盖。核黄素（E）需避光保存。玻璃管安装（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）加样电泳(-)(+)电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时止）剥胶固定和染色漂洗固定（时间5min）染色（时间2min）漂洗脱色至背景透亮实验分组（每人做一管，每4人配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管分离胶配制与灌胶（浓度为6%

3、，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm）封正丁醇（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样）倒掉正丁醇灌浓缩胶封正丁醇（观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）样品处理并加样（20ul）加buffer电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停止）剥胶固定（时间5min）染色（时间2min）漂洗脱色至背景透亮（一）电泳的基本原理及相关知识电泳的概念带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特

4、定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定电泳的基本原理主要利用分子之间的两个方面的差异来分离：分子所带电荷电荷性质（+/-）电荷数量分子形态分子量大小分子的三维构象形状电泳分离蛋白质的原理蛋白质两性解离与等电点溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量不同蛋白质分子大小和分子形状的差异实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）纸电泳醋酸纤维膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢。电泳的影响因素带电粒子的性质电场强度溶液的p

5、H溶液的离子强度电渗现象环境因素（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶两单体构成的人工合成凝胶丙烯酰胺（Acr）N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）作为电泳介质的优点自由调节孔径；韧性好；性质稳定；无电渗作用；无色透明。合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法化学合成系统过硫酸铵（AP）四甲基乙二胺（TEMED）光学合成系统核黄素四甲基乙二胺（TEMED）聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应凝胶孔径不同缓冲液pH不同缓冲液离子成分不同浓缩效应电荷效应分子筛效应Gly-Pro-Cl-Gly-P

6、ro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly）pH为6.7的浓缩胶pH为8.9的分离胶有效泳动率：MCl->MPro->MGly-Gly-Gly-Gly-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-快离子Cl慢离子GlyGlypK1=3.24pI＝6.0pK2=9.7－－浓缩效应浓缩效应可显著提高电泳的分辨率由较低浓度的丙烯酰胺构成;浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶;当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩

7、胶和分离胶之间.浓缩胶还具有比分离胶更低的pH浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH6.7）,该pH远低于Tris的pK值(8.1)。分离胶内的缓冲溶液是pH8.9的Tris-HCl，电泳正负两极的缓冲溶液均为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸的

8、解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，