[自然科学]分子克隆

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1、哺乳动物培养细胞的基因表达分析主讲人：张菲高蒙本章所介绍的两种实验方法，通常用来测量哺乳动物基因的转录活性以及对它们在转染细胞中的表达的调节。这里我们主要介绍两种实验方案。DNA酶Ⅰ足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图DNA结合蛋白的凝胶阻滞分析DNA酶Ⅰ足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图本方案介绍在放射性标记的DNA片段上确定蛋白质结合位点的作图方法。使用DNA酶Ⅰ切割，而在替代方案中是用羟自由基断裂DNA。原理材料方法替代方案原理：DNA酶Ⅰ足迹法（DNaseⅠfootprinting）是一种可以直接看到蛋白质和特定DNA序列结合的方法。该法常与凝

2、胶阻滞分析联用，鉴定结合在基因调控区序列上的核因子（kB体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递）。转录因子结合DNA，保护某个DNA片段不被DNA酶Ⅰ核酸裂解活性的作用，就会形成DNA酶Ⅰ“足迹”。通常试验中，在加或不加入核提取物的情况下用DNA酶Ⅰ分别对靶DNA片段进行切割，然后对所得图谱进行比较。在核提取物存在时，没发生酶切反应的地方，足迹会呈条带出现。DNA酶Ⅰ切割产物的电泳迁移率与同样的DNA片段所得到的序列梯带进行比较，就可确定足迹的位置，从而确定DNA结合蛋白的识别序列。具体方法是：先将待测双链

3、DNA片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记，加入假定的DNA结合蛋白孵育，然后加入恰当浓度的DNaseⅠ，使在DNA链上随机形成缺口，经变性后电泳分离，放射自显影，即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。但当DNA片段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合后，DNA结合蛋白可保护相应的DNA序列不受DNaseⅠ的攻击，因而在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断，从而形成一空白区域，恰似蛋白质在DNA上留下的足迹，因而被形象地称作足迹法。如果同时进行DNA化学测序，即可判断出结合区的精确顺序。材料：酶：DNA酶Ⅰ缓冲液

4、凝胶：聚丙烯酰胺凝胶核酸和寡聚核酸：为了减少蛋白与放射性标记的DNA片段的非特异性结合放射性化合物：32P末端标记的DNA细胞和组织细胞匀浆缓冲液细胞重悬缓冲液细胞淋洗缓冲液方法：1、制备核提取物①从组织制备核提取物②从培养细胞中制备核提取物③从小量培养细胞中制备核提取物注：此方法适应于转染有质粒的细胞，这些质粒能够表达编码转录因子的cDNA除了这些制备方法以外，纯化细胞方法得到的组分可以直接用于下一步实验。2、在离心管中加入：核提取物或蛋白组分32P末端标记的DNA1mg/mlpoly(dI-dC)H2O将这些按一定比例加入。3、室温下加入50μLMg

5、Cl2/CaCl2溶液并轻轻混匀。室温下放置1min,加入几微升稀释的DNA酶Ⅰ溶液，混匀。4、加入75μL终止液终止反应。摇匀后，用相同体积的酚/氯仿抽提反应液。5、把液相转移到新的离心管中，用两倍体积的乙醇沉淀核酸。6、加入少量甲醛染液，剧烈震荡使DNA沉淀溶解。煮3min使DNA变性。7、跑聚丙烯酰胺变性胶，注：在加样前进行至少30min的预电泳。8、电泳结束后，将胶真空干燥一个小时，然后用X射线胶片曝光，需在-20度曝光几小时。以上方法是基本的实验方案，但根据每一个实验的不同，我们还可以对它进行一些优化。优化方案：在反应混合物中单价阳离子浓度要小

6、于200mmol/L,通常是在50mmol/L范围内。高浓度会抑制甚至会破坏蛋白和带负电的DNA之间的相互作用。DNA酶Ⅰ足迹分析的缓冲环境是由核提取物中的组分提供的，所以必要时可以改变缓冲环境中的离子成分。对于每种DNA片段成分，Mg离子的最佳浓度都要确定。为了观察到足迹所需的蛋白抽提物的量要取决于该蛋白与DNA的亲和力。核提取物必须经过一次或多次层析才可以在实验中观察到足迹。DNA酶Ⅰ的量在实验过程中是比较重要的，确切的浓度要依靠试验本身来确定。酶切反应与DNA酶Ⅰ的比活，DNA片段的纯度，以及所分析的DNA的序列都是有关系的注：对于每一个进行分析的

7、DNA片段或组分，需要有两个对照反应。一个对照反应不含核提取物，可以鉴别裸DNA片段中能够抵抗DNA酶Ⅰ的下滑或只被部分消化的区域；另一个不在第二步中加入DNA酶Ⅰ，这样可以发现内源的内切核酸酶。替代方案：羟自由基足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图DNA酶Ⅰ切割DNA并不是随机的，因此在足迹实验中，观测到的条带图谱并不代表探针中的每个磷酸二酯键切点。只要在DNA结合蛋白保护的序列里有一处以上发生了酶切，就可以推断该蛋白是有两部分组成的。但是，如果目的蛋白结合位点在两个DNA酶Ⅰ切点之间，该蛋白和DNA的相互作用就会发生漏掉，为了避免这些问题并使足迹法的

8、分辨率提高到核苷酸水平，又引入了称为羟自由基足迹法的化学切割方法，依靠Fe（Ⅱ）