清华课件专题讲解

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1、透析通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析（下图）。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定。凝胶过滤凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶

2、的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。（下图）给出了凝胶过滤分离蛋白质的示意图。从（下图）中可以看出，大小不同的蛋白质分子可

3、以通过凝胶过滤分开。在一定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质分子量的测定。离子交换层析离子交换层析在氨基酸的分离一节中已经描述过，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱

4、的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。亲和层析这是一种最有选择性的柱层析，其原理是依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没

5、有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度的自由配体的溶剂，或是浓缩了的盐溶液洗脱（下图）。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。高压液相层析高压液相层析中也分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等层析技术，分离的原理与这些常规下的层析原理是一样的，只不过它所使用的基质株更小，孔径更均一，基质填充比常规下的层析柱更致密。与常规下的层析技术相比，在高压液相层析中，蛋白质混合物和溶剂通过一个泵的输送流经层析柱的。层析柱是由不锈钢制造的，每平方英寸可以承受几百磅的压力。计算机控

6、制样品和溶剂的流速可以使操作者任意地选择洗脱条件，以保证高重复性，很显然，利用高压液相层析可以大大提高速度、分辨率和灵敏度。SDS-PAGE电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starchgel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大

7、多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关，我们介绍其中常用的几种主要的电泳技术。　　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚

8、基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的