用弗氏柠檬酸菌酶法合成l酪氨酸

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1、项目四用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸目录L-酪氨酸L-酪氨酸的酶法合成弗氏柠檬酸菌的培养及破碎酪氨酸裂解酶的活力测定用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸L-酪氨酸L-酪氨酸属氨基酸的一种，结晶性粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸胡哦哦稀硝酸中溶解。从酪蛋白或玉米等含蛋白质物质的水解液中提取，是人体非必需氨基酸。医药上用作治疗甲状腺功能亢进，也可做为食品添加剂。中文名称:L-酪氨酸中文别名:L-β-对羟苯基-β-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸英文名称:L-Tyrosine

2、分子式:C9H11NO3分子量:181.19制备或来源：1.由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取；2.以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得；3.以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。用途：1.医药用作甲状腺功能亢进；2.食品添加剂。3.是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。4.广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。L-酪氨酸对皮肤的作用皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。在人的表皮基层细胞间，分布着

3、黑色素细胞，它含有的酪氨酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间再经过一系列的代谢过程，最后便可生成黑色素。黑色素生成得多，皮肤就越黑；反之，则皮肤就越白皙。研究证明，酪氨酸酶的活性与体内的铜、铁、锌等元素密切相关。经常进食富含酪氨酸和稀有元素锌、铜、铁的物质，例如动物内脏、肾，甲壳类动物蛤、蟹、河螺、牡蛎，水产品乌鱼子，豆类的大豆、扁豆、青豆、赤豆，硬壳果类花生、核桃、黑芝麻以及葡萄干等，皮肤的色泽就较黑。因此住在海边的人，打渔的渔民，由于吃以上水产品较多，因此皮肤色泽较黑。L-酪氨酸的酶法合成L-酪氨酸是目前仍采用水解法生

4、产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。酪氨酸酚裂解酶（tyrosinephenol-lyase），也称β-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必须氨基酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体重，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌、中间柠檬酸菌、弗氏柠檬酸以及嗜热菌和Symbi-obac

5、teriumtoebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。弗氏柠檬酸菌的培养及破碎弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧，为条件致病菌，广泛分布于自然界中，是人和动物(哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。药物敏感性试验结果表明，该菌对氟罗沙星、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7种抗生素高度敏感。特征特性：革兰

6、阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞，无荚膜。具有氨苄青霉素（Ampr）、卡那霉素（Kanr）、四环素（Tcr）及链霉素（Strr）抗性。光滑、低凸、温润、半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐。菌体杆状，直径1.0，长2—6μm。菌落直径2—4mm。出芽繁殖为主，酒类增香。用于白酒增香。可以含有10ppmMG的无机盐培养基中正常生长，最适生长温度为30℃。实验材料：菌株：弗氏柠檬酸菌（Citrobacterfreundii)试剂：LB培养基：配方：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15~20g、水100

7、0mL（调节pH7.4~7.6）实验操作1.菌种培养：配制培养基菌种活化待灭菌后的固体培养基冷却至50℃时，倒入平板中（大约每平板15mL），待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。接种好的平板倒置于培养箱中，37℃培养24h。扩大培养：挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体培养基的三角瓶中进行扩大培养。37℃、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多）2.破碎细胞菌体收集：取已经培养过夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心管中，3000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。细胞破碎：向

8、离心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）缓冲液（1:20），在漩涡混合器混合。然后再超声破碎仪下破碎，功率和时间根据菌液多少确定。功率不得太高，不要起气泡。循环次数不要太多，运行2s，间歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎前为乳白色，破碎后为透明。收集破碎液：将破碎好的液体倒入离心管中离心，3000r/min离心5min。弃沉淀，上清液备用。