植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选

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1、细胞克隆与种子细胞筛选第三章细胞工程电子课件华中农业大学生命科学技术学院细胞克隆的概念与意义植物单细胞培养技术动物细胞克隆技术种子细胞筛选主要内容3.1细胞克隆的概念与意义细胞系细胞克隆细胞株直接从机体取材的细胞、组织或器官所做的原代培养，进行传代培养后形成的一群生物学特征不均一的细胞便称为细胞系(cellline)。有限细胞系（FiniteCellLine）无限细胞系（InfiniteCellLine）一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来。分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为细胞的克隆化（

2、cloning）。从原代培养物或细胞系中分离单个细胞进行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具有一定的生物学特性和遗传标记，并在继代培养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就称为细胞株(cellstrain)。3.2植物单细胞培养技术愈伤组织诱导平板培养看护培养微室培养其他改进培养技术3.2.1愈伤组织诱导诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残

3、渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。3.2.2平板培养所谓平板培养（platingculture）是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出

4、细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。3.2.3看护培养看护培养（nurseculture）技术首先是有Muir等（1954）设计的，其操作方法是在固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。3.2.4微室培养微室培养（micro-chamberculture）是为进行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程、胞质环流的规律等进行

5、活体连续观察。这一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究的优良实验体系。微室培养首先是由Jones等在1960年设计的。3.2.5其他改进培养技术Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法，该方法是在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层上，然后将培养细胞植于其中。3.3动物细胞克隆技术原代培养继代培养单细胞克隆3.3.1原代培

6、养primaryculture取材培养组织解离机械分离取材解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬酸钠。一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官，然后加以整理用于培养。动物细胞原代培养过程不同取材方法，原代细胞培养方式亦不相同.一般来讲，分离获得的材料多采用组织块培养，而通过解离获得的细胞材料多采用单层细胞培养和悬浮培养。培养方法组织块培养将组织剪切成碎块用平衡盐溶液漂洗在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等切成1mm3大小再漂洗2-3次转移到培

7、养瓶内培养。特点直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强，因此，短期组织块培养成为动物细胞培养的材料来源之一。将解离获得的细胞沉淀用培养液配制成需要的细胞悬液接种到培养瓶内水平放置，37℃下静止培养每隔1-2天换培养液一次培养一定时间后，细胞在培养瓶底即形成一单细胞层。单层细胞培养特点更换培养基容易便于观察不同条件对细胞生长的影响培养后期容易使用灌注技术改善营养条件细胞贴附于基底质上，更容易表达产物单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原代培养。

8、适用细胞具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。悬浮细胞培养在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，倍增时间在12-18h的细胞类型接种密度以2×104/ml为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度不超过2cm为好。基本方法与植物细胞的悬浮培养相似3.3.2继代培养subc