《酶联免疫分析法》PPT课件

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1、第七章酶联免疫分析法第七章酶联免疫分析法基本要求：了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液及ELISA法常用酶的底物系统，掌握ELISA的酶联方法和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握ELISA的定量计算，了解ELISA的灵敏度提高途径，熟悉ELISA放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶

2、联免疫分析常用的生物发光反应体系。第七章酶联免疫分析法第一节酶联免疫分析概述第二节光度酶联免疫分析第三节发光酶联免疫分析第一节酶联免疫分析概述一、免疫分析1、免疫分析发展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。宋代人工痘苗预防烈性传染病天花1971年第一届国际免疫学会议将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。“免疫（immunity）

3、”一词源于“immunitas”，原意是免除税赋和差役。研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。20世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。现代免疫学将“免疫”定义为：机体对“自己”和“异己”识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。第一节酶联免疫分析概述2、抗原、抗体与免疫反应抗原是能够引起免疫反应的分子。免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免

4、疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。第一节酶联免疫分析概述抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。例如无免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗体，尽管其结构与抗体相似。抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中也有存在

5、。抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具有高特异性（即专一性）和可逆性。第一节酶联免疫分析概述抗原、抗体发生如下免疫反应：Ag+AbAg-Ab该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为式中：[Ab]为游离的抗体结合位点的浓度；[Ag]为游离的抗原结合位点的浓度；[Ab-Ag]为抗原-抗体复合物的浓度；k1为正反应速率常数；k2为负反应速率常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。第一节酶联免疫分析概述这种抗原-抗体反应既可发生于体内（invivo），也可发生

6、于体外（invitro）。抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采用血清做试验，所以体外抗原-抗体反应也称为血清学反应（serologicreaction）。基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：①用已知抗原检测未知抗体；②用已知抗体检测未知抗原；③定性或定量检测体内各种大分子物质；④用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。第一节酶联免疫分析概述二、酶标记免疫分析法及常用标记酶1、免疫分析法分类免疫分析标记免疫分析放射免疫分析法化学发光免疫分析法电化学免疫分析法荧光免疫分析法酶联免疫分析法竞争性酶联免疫

7、分析非竞争性酶联免疫分析均相酶联免疫分析非均相酶联免疫分析非标记免疫分析沉淀反应、凝集反应、免疫电泳、免疫扩散第一节酶联免疫分析概述2、酶标记免疫分析法中使用的酶（1）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件：①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；③使用稳定性和保存稳定性好；④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶；第一节酶联免疫分析概述⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质；⑦酶的来源、纯化和供应较

8、方便，价格较低廉；⑧均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。第一节酶联免疫分析概述（2）酶的评价指标通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。RZ表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比值。酶的比活力指在特定