《表达载体》PPT课件

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1、西南大学生物技术专业基因工程1第五章表达载体第一节大肠杆菌表达载体第二节穿梭载体第三节整合载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！西南大学生物技术专业基因工程2一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。1、表达元件(expressionelements)：1）启动子(promoter)：三类，即lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。T7噬菌体启动子λ噬菌体的PL启动子。第一节大肠杆菌表达载体西南大学生物技术专业基因工程

2、32）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环结构而终止）。3）核糖体结合位点(ribosomebindingside,RBS)：Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要，一般3-11bp。2、表达形式完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。融合蛋白(fusionprotein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。西南大学生物技术专业基因工程43、表达的控制诱导表达系统：

3、IPTG防渗漏表达系统：lacIqPL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。二、利用T7噬菌体启动子的表达载体pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚合酶识别，可用IPTG诱导表达。西南大学生物技术专业基因工程5非融合型表达载体主要元件：强启动子、SD、起始密码子ATG、万能终止密码子。PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因西南大学生物技术专业基因工程6非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI西南大学生物技术专业基因工程7三、表达融合

4、蛋白的表达载体1、GST(glutahioneS-transferase,谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：如Amershamm公司的pGEX系列，其GST来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签和Xa因子酶工位点，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理可得到纯的目的蛋白。西南大学生物技术专业基因工程83、内含肽表达载体：如NEB公司的Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个

5、可自裂解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽(signalpeptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。西南大学生物技术专业基因工程9融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因西南大学生物技术专业基因工程10技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3’或5’端，但必须维持正确的ORF。选择合适酶切位点加人工合成的DNA

6、接头构建位相载体西南大学生物技术专业基因工程11----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列DNA序列西南大学生物技术专业基因工程12位相载体----含有3种读码框的系列载体西南大学生物技术专业基因工程13优点：表达效率高产物稳定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性西南大学生物技术专业基因工程14Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接

7、纯化产物，切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相载体融合型载体----pGEX系列西南大学生物技术专业基因工程15分泌型融合表达载体----pEZZ18西南大学生物技术专业基因工程16分泌型表达载体----pINIII-ompA1西南大学生物技术专业基因工程17四、表达产物的纯化1、包涵体(inclusionbody)的纯化：许多情况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去