《种烟草病毒TMV》PPT课件

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1、五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测植物病理学报ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA41(2):146-153(2011)介绍烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病(PVY)和烟草脉带花叶病(TVBMV)，通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物，建立了

2、能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明，多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒，并且灵敏度高目前检测手段目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及PCR技术。其中PCR技术具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点。多重RT-PCR技术：多重PCR是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。检测步骤1．1病毒总RNA的提取TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV核酸均为线状单链正义R

3、NA。植物总RNA的浓度及纯度是影响RT-PCR检测的关键因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长，容易造成总RNA降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对植物病毒进行PCR检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV等5种主要烟草病毒检测步骤1．2引物的设计与筛选应用PrimerPremier5．0引物设计软件分别设计这5种病毒的特异引物TMVcpF/TMVcpR、CMVcpF/CMVcpR、TEVcpF/TEVcpR、PVYcp

4、F/PVYcpR和TVBMVcpF/TVBMVcpR。由于多重RT-PCR要求在同一退火温度下同时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选，选择Tm值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV这5种病毒检测步骤1.3单重RT-PCR用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒cDNA第一链25μLPCR标准反应体系:14．3μLddH2O，2．5μL10×PCRbuffer［750mmol/LTris-HCl(pH8．8)，200mmol/L(NH4)2SO4，0．1%Tween20］，2μL25mmol/LMgCl2，2μLd

5、NTP(各2．5mmol/L)，1μL上游和下游引物混合物(各10μmol/L)，0．2μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)和2μLcDNA模板。PCR反应循环参数:94℃预变性3min;94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次;72℃延伸10min。取5μLPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较单重RT-PCR电泳检测结果以TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV5种病毒的反转录产物作为PCR反应的模板，经PCR扩增分别得到大小为237、273、347、456和547bp的5条特异性条带检测步骤1.4多重RT-PCR多重RT-PCR反应体系:取T

6、MV、CMV、TEV、PVY和TVBMV5种病毒的混合病株提取总RNA，反转录合成cDNA，将RT产物随机混合作为多重RT-PCR反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR反应。退火温度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、54℃和57℃;延伸时间分别为40、50、60、70、80和90s;循环次数选择20、25、30、35、40和45个循环进行多重RT-PCR体系优化优化后的5对引物比例为TMV∶CMV∶TEV∶PVY:TVBMV=1.4∶1∶1∶1∶1.5，5种模板的比例为TMV∶CMV∶TEV∶PVY∶TVBMV=1．4∶1∶1∶1∶1．6。。结果显示

7、，退火温度在48℃和51℃所获得的目的条带相对较好。延伸时间在60和90s能获得理想的结果，而且40、50、70和80s之间没有明显的差别(检测步骤1.6PCR产物的克隆和测序多重RT-PCR扩增DNA靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，纯化的PCR产物与pMD18-Tsimplevector4℃过夜连接，采用CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp抗性和半乳糖苷酶的底物X-gal进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落PCR和限制性酶酶切分析进一步筛