康为世纪技术讲座-上医WBIF

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1、WesternBlot&Immunofluorescencewww.cwbiotech.com01062667528北京康为世纪生物科技有限公司技术总监刘雪松2内容背景知识1WB操作流程2WB常见问题分析3IF操作流程4IF常见问题分析5生物学反应系统检测原理反应系统：蛋白与蛋白、核酸与核酸指示系统：酶、荧光素、同位素直接法间接法背景知识6抗原表位(epitope)是指抗原分子上具有决定和控制抗原特异性的特殊化学基团,可与相应抗体相结合的部位。又称为抗原决定簇。抗原(antigen,Ag)是一类能刺激人或动物机体产生特异性免疫应答，

2、并与免疫应答产物（抗体或效应细胞）结合，发生免疫效应的物质。包括蛋白质，多糖，多肽等。抗体(antibody,Ab)机体在抗原物质刺激下，由B淋巴细胞分化形成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。单克隆抗体和多克隆抗体7多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体。多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体：由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的,只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。制备单克隆抗体的流程抗原的种类一颗粒性抗原细胞，细菌二可溶性抗原表达蛋白合成多肽细菌或病毒的

3、某种蛋白抗原的要求1抗原量的要求，蛋白2mg,多肽5~6mg2纯度要求，蛋白纯度要90%以上，SDS-PAGE要一条带，多肽纯度要85%以上。3蛋白背景，是否带有标签蛋白？与其他蛋白的同源性康为提供的服务1蛋白表达，制备抗体2客户提供蛋白序列，我们提供蛋白表位预测、多肽合成，多肽与载体交联，制备抗体3抗体制备后的后续服务，抗体的纯化，蛋白A/G，抗原或多肽的特异性亲和纯化抗体的标记，HRP，FITC抗体识别不同表位的测定ELISA配对抗体的筛选IHC、WB的应用12一抗和二抗13一抗：针对抗原的抗体二抗：针对一抗的抗体单克隆抗体多克

4、隆抗体带标记的抗体（生物素、HRP、AP）应用研究检测样品中特异性蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的半定量分析蛋白质分子的相互作用研究14抗体的化学结构及其模式图15免疫球蛋白根据重链结构命名：IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε)，IgM(μ)抗体的化学结构及其模式图16五种免疫球蛋白只有两种类型的轻链：Kappa(κ)和Lambda(λ)每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。17内容背景知识1WB操作流程2WB常见问题分析3IF操作流程4IF常

5、见问题分析5WesternBlotting免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。间接WesternBlotting操作流程YYHRPHRPHRP发光或显色HRP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合43一抗与蛋白结合2漂洗和封闭1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上5底物与二抗HRP反应第一步：电泳分离蛋白质Bac-细菌蛋白抽提试剂Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂Yea-酵母蛋白抽提试剂Tis-组织蛋白抽提试剂Mem-真核细胞膜蛋白提取试剂盒Nc-细胞核/细胞浆抽提试剂盒WB过程中最重要的一点就是确定目

6、的蛋白在组织、细胞中的定位，选择合适的提取方法把目的蛋白提取出来才能进行后续的实验防止蛋白质的降解——蛋白抽提第一步：电泳分离蛋白质——定量BradfordBCALowry22SDS-PAGE第二步：转膜膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜转膜方法：半干转、湿转转膜确认印迹膜选择转移方法半干转湿转25注意：对于大分子量的蛋白建议使用湿转转膜后确认丽春红可逆染色与下游WB检测完全相容，无任何干扰蛋白质预染Marker实时监测分子量参照第三步：封闭封闭液选择BSA脱脂奶粉（涉及到生物素系统，避免使用）封闭条件优化时间温度电泳分离，转膜，固定

7、蛋白于膜上封闭第四步：抗体孵育一抗的选择单克隆抗体多克隆抗体二抗的选择HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小40Kd140Kd最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特异性好于AP抑制剂氰化物硫化物叠氮钠氰化物砷酸盐，有机磷二价阳离子螯合剂稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵发光底物ECL显色底物TMB，CN，DABNBT，BCI

8、P，NBT/BCIP两种常用检测酶系统的比较第五步检测方法化学显色法方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学发光法灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测康为世纪